[发明专利]铁皮枫斗对糖尿病肾病及肾小球系膜细胞信号检测方法

权利要求书

1.一种铁皮枫斗的药物用途，其特征在于，所述铁皮枫斗作为成分或唯一成分用于制备治疗糖尿病肾病的药物。

2.如权利要求1所述的铁皮枫斗的药物用途，其特征在于，所述药物为铁皮枫斗系列制剂。

3.一种验证权利要求1所述铁皮枫斗的药物作用的动物模型，其特征在于，所述动物模型为：

动物分组：将体重为180-200g的健康雄性大鼠70只，随机分为正常对照组和糖尿病组，正常组10只，糖尿病组60只；

动物建模：糖尿病组按60mg/kg一次性腹腔注射l％链脲佐菌素溶液，对照组注射等体积的枸橼酸缓冲溶液0.1mol/L，72h小时后尾取血测定血糖浓度，当浓度≥16.7mmol/L时建模成功；

建模成功动物分组：将建模成功的糖尿病大鼠随机分为模型对照组DM和DC治疗组，DC治疗组分为低剂量治疗组DC 0.2g/kg、中剂量治疗组DC 0.4g/kg和高剂量治疗组DC 0.8g/kg；

分组后培养：建模成功后DC治疗组分别按规定剂量每日灌胃一次，持续8周，正常对照组和模型对照组给予相同体积的生理盐水。

4.一种验证权利要求1所述铁皮枫斗的药物作用的铁皮枫斗对肾小球系膜细胞信号检测方法，其特征在于，所述铁皮枫斗对肾小球系膜细胞信号检测方法包括：

步骤一：HMC常规培养于37℃、5％CO₂含15％胎牛血清的DMEM培养基中；

步骤二：将细胞分为6组，分别为对照组Control，加入5.6mmol/L的葡萄糖；甘露醇组加入5.6mmol/L的葡萄糖和24.4mmol/L的甘露醇；高糖组HG加入30mmol/L的葡萄糖；DC干预1组，加入30mmol/L的葡萄糖和50mg/L的DC；DC干预2组，加入30mmol/L的葡萄糖和100mg/L的DC；DC干预3组，加入30mmol/L的葡萄糖和300mg/L的DC；

所述大鼠标本采集及生化指标的测定方法为：8周末，称量小鼠体重，并收集小鼠24h尿液用于测定24h尿蛋白UP，然后用水合氯醛腹腔麻醉后静脉取血并分离血清，置于-20℃保存，用于测定血肌酐Scr、尿素氮BUN，取双肾，充分灌洗、称重，肾重指数KI＝右肾重量/体重，右肾取肾皮质固定于4％的聚甲醛溶液中，剩余肾皮质置于液氮中保存待用，收集细胞用于蛋白和总RNA的提取。

5.一种验证权利要求1所述铁皮枫斗的药物作用的大鼠肾皮质组织和细胞中MDA-1、SOD的测定方法，其特征在于，所述大鼠肾皮质组织和细胞中MDA-1、SOD的测定方法为：采用硫代巴比妥酸TBA法检测各组脂肪过氧化物MDA含量，黄嘌嘌呤氧化酶法检测超氧化物歧化酶SOD活性。

6.一种验证权利要求1所述铁皮枫斗的药物作用的大鼠肾皮质组织中TGF-β、CTGF的测定方法，其特征在于，所述大鼠肾皮质组织中TGF-β、CTGF的测定方法为：采用免疫组化法测定肾皮质组织中TGF-β、CTGF的含量；分别加TGF-β一抗、CTGF一抗，孵育，加二抗，显色并复染，设置对照，高倍显微镜下(×400)每张切片随机选取5个不同的视野，测定光密度值并计算平均值。

7.一种验证权利要求1所述铁皮枫斗的药物作用的p-38MAPK的活性，TGF-β、CTGF蛋白的含量检测方法，其特征在于，所述p-38MAPK的活性，TGF-β、CTGF蛋白的含量检测方法为：采用Western印迹法分别提取大鼠肾组织和细胞中的蛋白并测定浓度；取裂解蛋白50μg，经8％SDS-PAGE电泳、转膜封闭，分别加入抗p-38MAPK抗体、抗TGF-β抗体、抗CTGF抗体，4℃孵育过夜，用TBST洗涤3次后加入用HRP标记的二抗，室温封闭2h，TBST洗涤后，加入ECL试剂，用Image J 1.48软件对各蛋白条带进行灰度值定量分析，各自重复3次。

8.一种验证权利要求1所述铁皮枫斗的药物作用的大鼠肾皮质及细胞中TGF-βmRNA和CTGF mRNA表达水平的检测方法，其特征在于，所述大鼠肾皮质及细胞中TGF-βmRNA和CTGFmRNA表达水平的检测方法为：采用RT-PCR法进行检测，首先采用Trizol法抽取总RNA，使用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA，在ABI 7500实时荧光定量PCR仪上进行定量分析，然后应用2^-△△ct法对结果进行分析；

在ABI 7500实时荧光定量PCR仪的反应条件为：预变性95℃5min；95℃15s，退火60℃30s，40个循环；终末延伸72℃5min。