[发明专利]一种同时检测12种致病细菌的实时荧光定量PCR的方法

说明书

本发明提供一种同时检测12种致病细菌的实时荧光定量PCR的方法：收集目标致病菌特异性致病基因或毒素基因，以此为靶基因设计引物和探针，使反应条件一致；提取待检测样品基因组模板；将模板分别加入装有不同特异上下游引物和探针的小管中，再加入相应的荧光定量PCR试剂；在同一轮荧光定量PCR循环下，使相应引物和探针在各自的反应管内对样品同时、快速和定量检测。更加简便、快速、高效、经济的可同时检测饮水和食品中12种常见致病细菌（大肠杆菌O157：H7、单核增生李斯特菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、乙型溶血性链球菌、小肠结肠耶尔森氏菌、粪链球菌、志贺氏菌、奇异变形杆菌、河流弧菌、空肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌）。

技术领域

本发明涉及一种致病菌检测技术领域，特别是涉及一种采用简便、快速、高效、经济的高通量实时荧光定量PCR技术同时检测12种致病细菌的方法。

背景技术

人类的生产、生活废水和人畜粪便以及自然灾害都会使一些致病菌进入水体，引起水环境的污染，导致多种疾病的传播，如志贺杆菌和沙门氏菌等。同时现阶段，我国食品安全已经是不可忽视的问题，这关系着我国的民生大计，而近年来食品安全问题也得到了国家和人们的重视。我国也迫切需要对饮水和食品中常见致病菌实现高效准确、省时省力的检测办法，具备这些优点的检测方法才是饮水和食品安全的保障。

目前，对于饮水和食品中常见致病菌检测，常规方法需要进行反复增菌、分离培养、各种理化性质鉴定等操作，还有可能因为细菌浓度低而难于培养，不仅步骤繁琐、操作复杂，而且周期过长，难以及时报告结果，在检测速度、敏感性与特异性等方面有局限性，同时也难以实现当前批量样品检测的要求。而随着科学技术的飞速发展和创新，近年来也涌现了许多新方法，包括以抗原与抗体的特异性反应为基础建立的免疫学检测技术如酶联免疫吸附法（ELISA）等；以及分子生物学检测技术如聚合酶链式反应（PCR）、多重PCR、环介导恒温扩增技术（LAMP）、荧光定量PCR、基因芯片等，但他们都存在一定的不足。普通PCR可以实现对致病菌的快速检测，但灵敏度低且不能对致病菌进行定量；相对于普通PCR，多重PCR可以在同一个体系中检测多个目标菌，但多组引物之间容易相互干扰，对引物的要求也较高；LAMP技术具有反应体系小、灵敏度高、特异性好等优点但在扩增时引物间可能互补扩增出非特异性条带造成假阳性；基因芯片技术虽然快速而全面但重复性高、稳定性差且操作和后期处理比较复杂；多重PCR、LAMP、基因芯片虽然具备一次同时检测几种致病菌的能力，但最大的不足是不能对致病菌进行定量。荧光定量PCR虽可以对致病菌进行定量检测，但由于引物探针设计限制，使得一次实验可能只能检测一种致病菌，而本发明通过针对特异性致病基因进行引物和探针设计，并使反应条件一致，从而提出了一种同时检测12种致病菌的高通量实时荧光定量PCR方法。

发明内容

本发明为解决现有检测技术中存在的问题而提供一种更加简便、快速、高效、经济的可同时检测饮水和食品中12种常见致病细菌（大肠杆菌O157：H7、单核增生李斯特菌、沙门氏菌、副溶血性弧菌、乙型溶血性链球菌、小肠结肠耶尔森氏菌、粪链球菌、志贺氏菌、奇异变形杆菌、河流弧菌、空肠弯曲菌、金黄色葡萄球菌）的TaqMan探针高通量实时荧光定量PCR方法。

本发明采取的技术方案是：

一种TaqMan探针高通量实时荧光定量PCR同时检测饮水和食品中12种常见致病细菌的方法，主要包括针对文献调研获得的饮水和食品中12种常见致病细菌特异致病基因，设计引物和探针，根据Tm值和GC含量对设计的引物和探针进行优化使其能在同一个反应条件下进行实验；分别以倍比稀释的目标靶基因构建的DNA标准品为模板，加入相应引物和探针，进行Taqman探针法荧光定量PCR，根据探针中加入的荧光基团，软件对荧光信号进行实时收集，利用荧光信号累计，根据每个反应管内荧光信号到达设定阈值时的循环数与起始浓度对数值存在的线性关系实施对起始模板进行定量分析。