[发明专利]一种青霉素V酰化酶突变体、编码序列、重组表达载体、基因工程菌及应用

说明书

本发明提供了一种青霉素V酰化酶突变体、编码序列、重组表达载体、基因工程菌及应用。对Bacillus sphaericus来源的青霉素V酰化酶进行突变，获得的突变体PVA‑3的比活提高了9倍，固定化活力由92U/g提高到820U/g，在浓度为30％的青霉素V钾盐条件下孵育1小时，活性残余89.1％；固定化突变体PVA‑3应用于pH6.0，25℃条件下裂解25％浓度的青霉素V制备6‑APA的反应时间由180分钟缩短到60分钟，底物转化率提高至99.5％以上，且连续使用600批次以上，活力无明显的损失，具有很好的操作稳定性。突变后的PVA‑3极大程度地降低了生产成本，提高了生产效率，更适合于工业化应用。

技术领域

本发明属于基因工程及酶工程领域，具体涉及一种青霉素V酰化酶突变体、编码序列、重组表达载体、基因工程菌及应用。

背景技术

青霉素V是早期使用的一种青霉素类抗生素，其对多数革兰阳性菌、革兰阴性球菌、个别革兰阴性杆菌(如嗜血杆菌属)、螺旋体和放线菌均有抗菌活性，但对产β-内酰胺酶类的菌株无抗菌作用。目前，发酵生产的青霉素V(PenV)多半是用作生产β-内酰胺类抗生素中间体6-氨基青霉烷酸(6-amino-penicillanic acid，6-APA)的原料。6-APA是合成阿莫西林和氨苄西林的一种重要中间体。

当前，β-内酰胺类抗生素工业生产6-APA主要是利用青霉素G酰化酶(penicillinG acylase，PGA，EC 3.5.1.11)水解青霉素G钾盐来获得，同时还有一部分厂家通过化学法或利用青霉素V酰化酶(penicillin V acylase，PVA，EC 3.5.1.11)水解青霉素V钾盐的方式获得6-APA，青霉素V酰化酶的反应原理如下图所示。

相对于利用PGA酶法生产6-APA，利用PVA酶法生产6-APA具有以下优点：(1)能催化更高的底物浓度。青霉素G钾盐的底物浓度最高为8％，其转化率为97.5％，而青霉素V钾盐的底物浓度可以达到12％，转化率为99％左右，6-APA产量更高；(2)具有更好的反应pH。PGA的反应pH在8.0左右，在该pH条件下产生更多的副产物，而PVA的最适反应pH在5.5—8.5之间，酸性偏中性pH值副产物更少，6-APA更稳定；(3)产品6-APA的品质更佳。PGA生产的6-APA其副产物苯乙酸难于分离，易带入下游合成的抗生素中，引起过敏反应，而PVA生产的6-APA其副产物为苯氧乙酸，苯氧乙酸很容易就能与6-APA分离开，其得到的6-APA纯度更高、品质更好。因此，抗生素工业中开发一种优良的青霉素V酰化酶具有很好的市场前景。

野生型的青霉素V酰化酶广泛分布于各类微生物中。许多野生型的PVA被国内外科研工作者筛选、克隆并表达出其编码的基因，如中国专利CN1132251公开了一种尖孢镰孢来源的新型青霉素V酰化酶编码基因并进行了异源宿主表达，其活力为130U/ml；冯瑛、董志扬等对来源于尖镰孢FP941的青霉素V酰化酶进行了发酵、纯化和固定化研究，其固定化酶活力为210U/g，使用25批次后，酶活力保留90％；专利WO2005/066336公开了一种来源于Bacillus sphaericus的青霉素V酰化酶基因并进行了大肠杆菌重组表达，其发酵活性达到203.68U/g细胞干重；Demin Zhang等公开了一种来源于Streptomyces mobaraensis的新型青霉素V酰化酶编码基因并对该酶进行了性质研究；Jesus Torres-Bacete等对Streptomyces lavendulae来源的PVA进行了固定化研究，连续使用50批次，活力没有明显减弱；V.S.Avinash等对Pectobacterium atrosepticum来源的青霉素V酰化酶进行了大肠杆菌重组表达，其比活力可达430U/g。