[发明专利]利用CRISPR-Cas9系统敲除甘蓝型油菜BnMAX1基因的方法及应用

说明书

本发明公开了一种利用CRISPR‑Cas9系统敲除甘蓝型油菜BnMAX1基因的方法及应用，设计了两种特异性靶向甘蓝型油菜BnMAX1基因的sgRNA并制成oligo二聚体，与Cas9载体连接，通过农杆菌介导的遗传转化技术导入到甘蓝型油菜下胚轴愈伤并再生成苗，Cas9核酸酶在sgRNA的引导下，剪切目标序列，每条sgRNA都能通过CRISPR‑cas9系统介导A和C基因组上BnMAX1基因的剪切，达到基因敲除的目的。经过表型鉴定，发现纯合突变株系增加了分枝数、单株角果数，降低植株高度，同时也增加了产量。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及两种特异性靶向甘蓝型油菜 BnMAX1基因的sgRNA以及利用CRISPR-Cas9系统敲除甘蓝型油菜BnMAX1 基因的方法，可用于培育抗倒伏、高产的油菜品种。

背景技术

甘蓝型油菜(Brassica napus L.)属于十字花科芸薹属，是全球总产量居于第二位的大宗油料作物，也是我国最重要的油料作物之一，其生产的菜籽油占我国食用植物油供给的一半，我国油菜种植面积和产量均居世界第一，然而单产低于加拿大、澳大利亚等国家。影响油菜产量的农艺性状主要有株高、有效分枝数、分枝部位以及开花时间等。分枝数是农作物产量相关的重要株型性状之一，在油菜中，增加单株分枝数可显著增加全株角果数，进而提高单株产量，同时研究发现油菜分枝数与种子产量呈极显著正相关。株高也是作物重要的株型性状，适当降低株高可以提高作物的抗倒伏能力，提高产量和利于机械化收获。矮秆基因已经在水稻和小麦种取得了“绿色革命”的巨大成功。油菜矮秆性状对于抗倒伏和提高产量具有极其重要的意义。

传统的杂交育种为我国油菜单位产量的提高起到关键作用，但是也存在着很多制约因素，如制种效率不高，育种耗时长，劳动强度大以及环境影响大等问题，而如今的植物基因组工程技术则为解决这些难题提供了更多更好的选择。

CRISPR-Cas9原是细菌和古细菌应对外源病毒入侵的防御系统，现已经广泛的用于人类细胞、小鼠、斑马鱼、水稻等的基因改造。它主要由导向序列sgRNA 和Cas9核酸酶两种元件组成，sgRNA可以通过碱基互补识别基因组中特定序列，引导Cas9核酸酶对其DNA双链进行切割，造成双链断裂(DSB)，当细胞通过同源重组(HR)或非同源重组(NHEJ)进行DNA修复，这种不精确的修复方式就可以产生基因的定点突变，造成基因沉默，完成打靶。由于对DNA的剪切依赖于sgRNA于基因组特定序列的配对，因而设计特异性的靶向sgRNA是避免脱靶效应的关键。

虽然CRISPR技术是基因功能研究的利器，也可用于基因编辑以改良农作物，但如在小麦，油菜等多倍体作物中，由于基因在各亚基因组中都有拷贝，这大大提高了CRISPR-Cas9打靶的难度，只有将这些同源拷贝一并沉默掉，才是一次成功的打靶。因而对sgRNA的设计提出了更高的要求：如必须在所有同源基因的保守区域设计或者设计串联的sgRNA靶标位点。

发明内容

本发明的目的在于提供了两种特异性靶向甘蓝型油菜BnMAX1基因的 sgRNA，两种sgRNA设计于该基因的第一外显子中，每条sgRNA都能通过 CRISPR-cas9系统介导A和C基因组上BnMAX1基因的剪切，达到基因敲除的目的。

本发明的另一个目的在于提供了一种利用CRISPR-Cas9系统敲除甘蓝型油菜BnMAX1基因的方法及其应用，通过设计oligo DNA序列和商业化 CRISPR-Cas9载体，能够快速构建BnMAX1基因敲除载体，通过农杆菌介导的遗传转化，筛选获得的BnMAX1基因敲除的突变株可用于油菜性状改良。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

利用CRISPR-Cas9系统特异性敲除甘蓝型油菜BnMAX1基因的方法，该方法包括以下步骤：