[发明专利]一种筛查谷氨酸棒杆菌中蛋白相互作用的方法

说明书

一种筛查谷氨酸棒杆菌中蛋白相互作用的方法。所述方法包括：(1)利用基因工程技术将谷氨酸棒杆菌中目的基因克隆到原核表达载体(2)构建蛋白表达菌株并进行目的蛋白的大量表达(3)谷氨酸棒杆菌胞内蛋白的提取(4)对目的蛋白进行纯化并进行His‑Pull Down实验捕获相互作用蛋白(5)对His‑Pull Down后的蛋白进行还原烷基化和胶内酶解，并通过液相色谱质谱联用仪鉴定获取的目的基因互作蛋白。本发明对理解谷氨酸棒杆菌代谢过程中蛋白的相互作用具有重要的意义，进一步基于关键蛋白之间的相互配合关系，相应地进行协调代谢工程改造以及其他方面的运用，因而具有重要的应用价值。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种筛查谷氨酸棒杆菌中蛋白相互作用的方法。

背景技术

谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)，被广泛应用于L-谷氨酸、L-赖氨酸等大多数氨基酸的生产，在工业应用方面有着举足轻重的地位。在谷氨酸棒杆菌中，各种氨基酸，特别是分支链氨基酸(缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)的合成途径存在密切的关联，多种关键酶之间相互影响。蛋白质相互作用研究的不足，限制了谷氨酸棒杆菌的进一步工业应用。近年来，通过将生物化学、生物物理学，分子生物学、遗传学、微生物学、蛋白质组学和生物信息学等的理论和研究成果有机结合，发展了许多有效的研究蛋白质间相互作用的方法。这些方法设计巧妙实用，能全面的揭示生命现象中生物功能的精确调控过程和影响生命变化的分子基础，不仅有极大的实用价值，而且有潜在的启发和指导意义。现阶段人们对谷氨酸棒杆菌中的蛋白相互作用研究较少。针对这一现状，本发明提供了一种筛查谷氨酸棒杆菌中蛋白相互作用方法，对于解析谷氨酸棒杆菌中氨基酸合成的相互关联，拓宽谷氨酸棒杆菌的工业应用具有重要的意义。

发明内容

本发明目的是解决筛查谷氨酸棒杆菌中蛋白相互作用的问题，提供一种筛查谷氨酸棒杆菌中蛋白相互作用的方法，采用本方法能够简单快速的寻找到谷氨酸棒杆菌中与目的蛋白质存在相互作用的蛋白。利用该方法获得的谷氨酸棒杆菌中蛋白相互作用关系，为进一步协调代谢工程改造以及在其他方面的应用提供有效策略和指导。

本发明所采用的技术方案如下：

一种筛查谷氨酸棒杆菌中蛋白相互作用的方法，包括以下步骤：

1.目的基因的克隆以及原核表达载体构建

根据谷氨酸棒杆菌目的基因的全序列，在目的基因两端引入双酶切位点，利用PCR技术扩增目的基因片段，并进行测序验证。将克隆产物和带His-Taq的原核表达载体用相同内切酶进行酶切并连接，构建好的原核表达质粒转化到大肠杆菌E.coliDH5α中，提取质粒并对构建好的质粒进行双酶切验证。

2.构建蛋白表达菌株以及目的蛋白的大量表达；

将步骤1中构建好的载有谷氨酸棒杆菌目的基因的原核表达载体转化到大肠杆菌E.coliBL21或者E.coliRosetta菌株中，添加诱导剂诱导目的基因表达，通过SDS-PAGE检测目的蛋白表达情况。从诱导温度、诱导时间、加诱导剂时OD和诱导剂的添加量等方面对目的蛋白表达条件进行优化以确定最佳条件，使带His-Taq的可溶性目的蛋白大量表达。

3.谷氨酸棒杆菌胞内蛋白的提取；

收集菌体，先用液氮研磨2～4次，用Lysis buffer重悬，加入蛋白酶抑制剂，在冰上进行超声破碎。离心收集上清。

4.对目的蛋白进行纯化以及用His-Pull Down技术捕获互作蛋白；