[发明专利]一种基于海洋微生物的抗菌活性物质的制备方法

权利要求书

1.一种基于海洋微生物的抗菌活性物质的制备方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

S1、菌株的分离纯化

取10g印度洋深海沉积物样品于灭菌的试管中，加入100mL无菌海水，振荡混匀得到匀浆，此为10^-1稀释度，按照此方法依次做梯度稀释，得到10^-2、10^-3、10^-4稀释度，依次吸取100μL各个不同稀释度的海水放于固体培养基平板上，用无菌涂布棒将液体均匀涂布在整个平板表面，然后置于20℃培养箱中培养4-7天；从固体培养基上选取长有单一菌落的真菌菌丝体，采用平板划线法，挑取一环真菌菌丝或孢子，在新平板表面划线5-6下，然后倒置于20℃培养箱中培养7天，即得到了曲霉属真菌；将纯化好的曲霉属真菌菌株接种于斜面固体培养基保种管内，待曲霉属真菌菌落长成后保存备用；

S2、发酵培养

将曲霉属真菌菌株从保种管斜面接种到真菌液体培养基平板上，于26℃培养7天作为种子板，从液体平板培养基上用接种针挑取真菌菌落接种到30个含有400ml发酵真菌液体培养基的1000ml锥形瓶中，在26℃、静置无光照条件下发酵培养40天，获得发酵培养液；

S3、菌株次生代谢产物的提取

将步骤S2得到的发酵培养液用纱布抽滤，滤液用等体积乙酸乙酯萃取三次，得到发酵粗浸液；菌丝体滤渣先用75％乙醇超声提取，所得的提取液浓缩至没有乙醇后，再用等体积的乙酸乙酸萃取三次，得到菌丝体粗浸液，将发酵粗浸液与菌丝体粗浸液合并，即得到了菌株次生代谢产物粗提液；

S4、菌株次生代谢产物的纯化

往菌株次生代谢产物粗提液中加入硅胶，混合均匀后过Rp-18反相硅胶柱，使用石油醚：乙酸乙酯梯度洗脱，收集各个洗脱液，减压浓缩、合并，分离得到了2个抗菌活性化合物A和B；

所述的抗菌活性化合物A和B的结构式为：

2.根据权利要求1所述的一种基于海洋微生物的抗菌活性物质的制备方法，其特征在于：所述的固体培养基为：小麦粉17g，可溶性淀粉5g、葡萄糖3g，蛋白胨3g，琼脂20g，氯霉素0.1g，无菌海水1L，各组分混合均匀后，采用pH调节剂调节固体培养基pH为7.0-7.5。

3.根据权利要求2所述的一种基于海洋微生物的抗菌活性物质的制备方法，其特征在于：所述的pH调节剂为20％的磷酸二氢钾水溶液。

4.根据权利要求1所述的一种基于海洋微生物的抗菌活性物质的制备方法，其特征在于：步骤S1中，培养箱中培养7天后，若菌落不纯，继续反复划线分离，直至得到单一菌落为止。

5.根据权利要求1所述的一种基于海洋微生物的抗菌活性物质的制备方法，其特征在于：步骤S1中，曲霉属真菌菌菌落长成后置于冰箱0-3℃保存。

6.根据权利要求1所述的一种基于海洋微生物的抗菌活性物质的制备方法，其特征在于：所述的液体培养基为：小麦粉17g，酵母粉2g，葡萄糖3g，蛋白胨3g，无菌海水1L，各组分混合均匀后，采用pH调节剂调节固体培养基pH为7.0-7.5。

7.根据权利要求6所述的一种基于海洋微生物的抗菌活性物质的制备方法，其特征在于：所述的pH调节剂为10％的磷酸二氢钾水溶液。

8.根据权利要求1所述的一种基于海洋微生物的抗菌活性物质的制备方法，其特征在于：步骤S4所述的梯度洗脱的具体过程为：首先采用石油醚：乙酸乙酯＝9:1，进行洗脱3-4h,接着以石油醚：乙酸乙酯＝1:1，收集洗脱液浓缩后得到抗菌活性化合物A；继续以石油醚：乙酸乙酯＝1:7.5，收集洗脱液浓缩后得到抗菌活性化合物B。