[发明专利]敲除载体、打靶载体、肝脏细胞中的PPARG基因的体外敲除方法以及敲除肝脏细胞

权利要求书

1.一种敲除载体，其特征在于，所述敲除载体包括CRISPR/Cas9载体骨架和连接到所述CRISPR/Cas9载体骨架上的一段互补DNA序列；

所述CRISPR/Cas9载体骨架能够表达Cas9核酸酶；

所述互补DNA序列能够被对应地转录为特异性识别PPARG基因中的特定序列的sgRNA，所述sgRNA能够与所述PPARG基因中所述特定序列的互补链互补配对，使所述Cas9酶特异地切割所述特定序列，所述特定序列包括如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5及SEQ ID NO.6中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的敲除载体，其特征在于，如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5及SEQ ID NO.6所示的所述特定序列分别对应的所述互补DNA序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16及SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18所示。

3.根据权利要求1所述的敲除载体，其特征在于，所述敲除载体通过以下步骤制备：

将所述互补DNA序列退火形成双链寡核苷酸片段；

提供所述CRISPR/Cas9载体骨架，所述CRISPR/Cas9载体骨架的粘性末端的序列能够与所述双链寡核苷酸片段的粘性末端的序列互补配对；以及

将所述CRISPR/Cas9载体骨架和所述双链寡核苷酸片段连接形成闭合环状质粒。

4.一种打靶载体，其特征在于，所述打靶载体与根据权利要求1-3任一项所述的敲除载体配合使用以敲除肝脏细胞中的所述PPARG基因，所述打靶载体包括依次连接的5’同源基因、标记基因以及3’同源基因，所述5’同源基因与肝脏细胞中含有所述PPARG基因的染色体上的PPARG基因的切割位点的上游端相邻基因的序列同源，所述3’同源基因与所述肝脏细胞中含有所述PPARG基因的染色体上的PPARG基因的切割位点的下游端相邻基因的序列同源，所述标记基因用于对敲除所述PPARG基因后的所述肝脏细胞的鉴定。

5.根据权利要求4所述的打靶载体，其特征在于，所述5’同源基因以所述肝脏细胞基因组DNA为模板，以如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20所示的序列为引物经PCR合成。

6.根据权利要求4所述的打靶载体，其特征在于，所述3’同源基因以所述肝脏细胞基因组DNA为模板，以如SEQ ID NO.21和SEQ ID NO.22所示的序列为引物经PCR合成。

7.根据权利要求4所述的打靶载体，其特征在于，所述标记基因为嘌呤霉素抗性基因，所述嘌呤霉素抗性基因以如SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24所示的序列为引物经PCR合成。

8.一种肝脏细胞中的PPARG基因的体外敲除方法，包括以下步骤：

提供根据权利要求1-3任一项所述的敲除载体；

提供根据权利要求4-7任一项所述的打靶载体；以及

将所述敲除载体和所述打靶载体共同转染到所述肝脏细胞。