[发明专利]一种检测牛布鲁氏菌HSP70的间接ELISA的建立方法

说明书

本发明公开了一种检测牛布鲁氏菌HSP70的间接ELISA的建立方法，具体步骤如下：制备牛布鲁氏菌HSP70的融合蛋白，并对蛋白进行纯化，获得纯化的蛋白；以获得的纯化的蛋白为抗原检测布鲁氏菌血清样本，同时确定抗原包被浓度、血清稀释度、封闭液种类、二抗稀释浓度以及显色时间；确定间接ELISA的临界值；间接ELISA结果判定标准；分析间接ELISA方法的敏感性和特异性。本发明具体通过对HSP70进行原核表达，获得纯化的蛋白，以纯化蛋白作为抗原，建立检测牛布鲁氏菌间接ELISA的方法，为布鲁氏菌病的血清学检测提供重要方法。

技术领域

本发明涉及一种检测牛布鲁氏菌HSP70的间接ELISA的建立方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

布鲁氏菌病严重影响畜牧业发展，对人类健康造成极大威胁。通常，人的感染主要通过接触带菌动物或消费被细菌污染的动物产品，因此，控制和清除带菌动物对于控制该病具有关键意义。动物布鲁氏菌病的筛查依赖于实验室诊断，国际兽医局(OIE)推荐的诊断方法有：布鲁氏菌的分离鉴定、虎红凝集试验、试管凝集试验、PCR技术和补体结合试验等。细菌分离是布鲁氏菌病诊断的“金标准”，但是布鲁氏菌属于危险病原，试验要求高，且分离率非常低，不适于大规模检疫；PCR检测方法敏感性高，特异性差；补体结合试验具有良好的特异性和敏感性，但是同样存在试验要求较高的缺点；虎红凝集试验和试管凝集试验敏感性较高，但容易造成假阳性。

因此，提供一种敏感性和特异性好，易于操作和标准化的检测牛布鲁氏菌HSP70的间接ELISA(iELISA)的建立方法，是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种敏感性和特异性好，易于操作和标准化的检测牛布鲁氏菌HSP70的间接ELISA的建立方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种检测牛布鲁氏菌HSP70的间接ELISA的建立方法，具体步骤如下：

(1)制备牛布鲁氏菌HSP70融合蛋白，并对蛋白进行纯化，获得纯化的蛋白；

(2)以步骤(1)获得的纯化的蛋白为抗原检测布鲁氏菌血清样本，同时确定抗原包被浓度、血清稀释度、封闭液种类、二抗稀释浓度以及显色时间；

(3)确定间接ELISA的临界值：临界值＝平均值+2.58×标准差；平均值为阴性血清间接ELISA结果的平均值，标准差为阴性血清间接ELISA结果的标准差；间接ELISA结果判定标准：布鲁氏菌血清样本的OD值大于等于临界值判断为阳性，布鲁氏菌血清样本的OD值小于临界值判断为阴性；

(4)分析间接ELISA方法的敏感性和特异性。

进一步，步骤(1)所述制备牛布鲁氏菌HSP70融合蛋白的步骤如下：

1)PCR扩增HSP70基因；

2)构建重组表达载体pET32a-HSP70；

3)将重组表达载体转化DH5α感受态细胞，挑取单克隆进行PCR和双酶切验证，获得阳性克隆，提取质粒，测序；

4)将重组表达载体pET32a-HSP70转化BL21(DE3)菌株，获得重组表达菌株pET32a-HSP70/BL21(DE3)；

5)利用IPTG诱导重组表达菌株，获得融合蛋白；

6)利用SDS-PAGE分析融合蛋白表达情况；

7)对融合蛋白进行Western blot验证。

进一步，检测牛布鲁氏菌HSP70的间接ELISA方法在鉴别牛布鲁氏菌中的应用。