[发明专利]一种利用结构特异性核酸内切酶的基因克隆方法

权利要求书

1.一种利用结构特异性核酸内切酶的基因克隆方法，其特征在于，包括步骤为：（1）利用引物扩增载体和目标基因，使所述载体和所述目标基因的两端产生同源区域；（2）将步骤（1）得到的所述载体和所述目标基因混合并杂交配对连接，产生flap 结构，得到带flap 结构的重组DNA分子；（3）将步骤（2）得到的带flap 结构的重组DNA分子用结构特异性核酸内切酶Fen1切除，得到含目标基因的带缺口的重组载体；（4）步骤（3）得到的含目标基因的带缺口的重组载体转化大肠杆菌后，所述含有目标基因的重组DNA的缺口被修复好，得到含目标基因的完整重组载体。

2.根据权利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，步骤（1）中所述引物的序列特征为：扩增目标基因和载体的正向引物5’端的第1-40位碱基序列是互补配对的，扩增目标基因和载体的反向引物5’端的第1-40位碱基序列是互补配对的；3’端下游碱基序列与所述目标基因和载体的待扩增DNA片段两端碱基序列配对。

3.根据权利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，步骤（1）中所述扩增采用的是聚合酶链式反应PCR，扩增反应缓冲液中包括有用于扩增目标基因和载体的正向引物、用于扩增目标基因和载体的反向引物、目标核酸模板分子、DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸。

4.根据权利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，步骤（1）中还包括用限制性核酸内切酶Dpn I对扩增后的载体进行消化处理，去除野生型环状质粒。

5.根据权利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，步骤（1）中所述载体和所述目标基因的两端产生20-40bp同源区域。

6.根据权利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，步骤（2）和（3）在同一体系中进行，步骤（2）中的杂交配对连接和步骤（3）中的切除是先在温度为95度下反应30秒，再在温度为50-70度下反应3-5分钟，如此循环10-30次，进行热循环酶切反应。

7.根据权利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，所述利用结构特异性核酸内切酶的基因克隆方法还包括对含目标基因的完整重组载体的鉴定：挑取单菌落，利用扩增目标基因的引物与Taq DNA聚合酶进行菌落PCR，鉴定含目标基因的完整重组载体的阳性克隆，培养阳性克隆，并抽提含目标基因的完整重组载体。

8.根据权利要求1所述的基因克隆方法，其特征在于，所述利用结构特异性核酸内切酶的基因克隆方法用于基因点突变，包括步骤为：（1）利用引物扩增野生型基因的质粒载体；（2）将步骤（1）得到的扩增后的质粒载体加热退火产生flap 结构，得到带flap 结构的突变型质粒载体；（3）将步骤（2）得到的带flap 结构的突变型质粒载体用结构特异性核酸内切酶Fen1切除，再自我杂交配对，得到含突变型目标基因的带缺口的质粒载体；（4）步骤（3）得到的含突变型目标基因的带缺口的质粒载体转化大肠杆菌后，所述含突变型目标基因的重组DNA的缺口被修复好，得到含突变型目标基因的完整重组质粒载体。

9.根据权利要求9所述的基因克隆方法，其特征在于，步骤（1）中所述扩增采用的是聚合酶链式反应PCR，扩增反应缓冲液中包括有用于扩增的正向引物、用于扩增的反向引物、野生型质粒模板分子、DNA聚合酶、4种脱氧核苷三磷酸；步骤（1）中还包括用限制性核酸内切酶Dpn I对扩增后的载体进行消化处理，去除野生型目标基因的环状质粒模板。

10.根据权利要求9所述的基因克隆方法，其特征在于，步骤（2）和（3）在同一体系中进行，步骤（2）中的杂交配对连接和步骤（3）中的切除是先在温度为95度下反应30秒，再在温度为50-70度下反应3-5分钟，如此循环10-30次，进行热循环酶切反应；所述利用结构特异性核酸内切酶的基因克隆方法用于基因定点突变还包括对含突变型目标基因的完整重组质粒载体的鉴定：挑取单菌落，培养阳性克隆，并抽提含突变型目标基因的完整重组质粒载体进行测序，验证点突变。