[发明专利]AKR在MIN6细胞中胰岛素分泌机制研究的应用

权利要求书

1.一种AKR在MIN6细胞中胰岛素分泌机制研究的应用，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、细胞培养

用含15％胎牛血清、4.5g/L葡萄糖、2％青链霉素、1％L-谷氨酰胺及1％β-巯基乙醇的DMEM培养基，在37℃含5％CO₂的培养箱中培养，传代至4～15代用于实验；

步骤2、分组

将MIN6细胞以4×10⁵/孔于6孔培养板中培养，在对数生长期用于实验；一组用于ELISA检测MIN6胞内未添加ISO胰岛素释放量，一组用于ELISA检测MIN6胞内添加ISO胰岛素释放量，细胞分为3部分后分别在无糖、低糖、高糖环境下培养，之后给予不同浓度的Glg：0、500、1000ng/L，干预处理；一组用于FRET技术检测PKA水平；

步骤3、方法

3.1基于FRET技术在不同浓度葡萄糖和GC干预下实时定量检测PKA；

3.2ELISA法检测各组MIN6细胞胰岛素的释放量；

3.2.1采集MIN6细胞胰岛素样品；

(1)MIN6细胞传代于5个6孔培养板，待其贴壁稳定，状态良好；

(2)小心吸出培养基，换入含2％FBS的培养基，继续在37℃环境下培养；

(3)培养12h后吸出原有培养基，用Krebs液轻轻冲洗1次，在每孔培养皿加入1ml Krebs液，在37℃环境下孵育2h；

(4)吸出原有Krebs液，向各孔培养皿中分别加入处理液1ml，空白对照组直接加入1mlKerbs，37℃培养箱孵育1h；

(5)分别吸取每孔的细胞上清液，移入1.5ml离心管，做好标记后剪取封口膜密封，保存于-20℃冰箱待测；

3.2.2测定MIN6细胞上清中胰岛素

(1)准备试剂盒：

(2)检测程序：

(3)结果计算与判断：

①以4000pg/ml、2000pg/ml、1000pg/ml、500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、0pg/ml浓度的标准品为横坐标，以相对应的OD值为纵坐标，画出标准曲线图；

②根据测得的细胞上清液样品OD值，在标准曲线上计算出相应胰岛素含量，乘上稀释倍数后得出样品内胰岛素含量；

步骤4、统计学方法

采用SPSS17.0统计软件进行数据处理，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，多组间均数的比较采用单因素方差分析，采用双侧检验，P<0.05认为差异具有统计学意义。

2.根据权利要求1所述的AKR在MIN6细胞中胰岛素分泌机制研究的应用，其特征在于，步骤3.1具体为：

(1)在荧光显微镜下观察转染48h后的MIN6细胞，其荧光蛋白表达良好，转染效率80％-90％；

(2)小心吸出原有培养基，Krebs液冲洗2遍；

(3)每个培养皿中加入0.5ml Krebs液，放回培养箱；

(4)任取一个培养皿，放在激光共聚焦显微镜下，定位单个细胞后换用油镜观察；

(5)在激光共聚焦计算机软件上设置好激发波长和发射波长范围，开始采集图像；

(6)各培养皿根据实验分组依次加入药物；

(7)以时间为横坐标、CFP/YFP比值为纵坐标画图。

3.根据权利要求1所述的AKR在MIN6细胞中胰岛素分泌机制研究的应用，其特征在于，所述准备试剂盒具体为：

①打开10×标本稀释液母液包装，按照10×标本稀释液:双蒸水＝1:10的比例，加入双蒸水稀释标本稀释液；

②标准品液的配制：打开标准品液包装，用微量移液枪加入500μl双蒸水混匀，将其配制成40ng/ml的溶液；准备8个干净的离心管，分别标记1-8，向管1中加入900μl标本稀释液，管2至管8中各加入500μl标本稀释液；向管1中加入100μl 40ng/ml的标准品溶液混匀，用微量移液枪从其中吸出500μl移至管2，如此反复操作，将各管溶液进行稀释，最后从管7中吸出500μl弃去，管8作为空白对照；

③按照洗涤液母液液:双蒸水＝1:10的比例，稀释洗涤液；

④按照标本:双蒸水＝1:20的比例，稀释收集到的细胞上清液标本。