[发明专利]一种在液体活检中检测端粒酶活性的方法

说明书

本发明公开了一种在液体活检中检测端粒酶活性的方法，是在筛选癌细胞完毕后，利用亲和素标记的磁珠吸附用生物素标记已经延伸好的产物，从而达到去除液体中蛋白质等其他杂质的影响。本发明与现有技术相比的优点是：本方法在筛选癌细胞完毕后，加入1×TRAP体系、生物素标记的TS引物、dNTP、RII，利用超声破碎细胞后，进行30度水浴30分钟延伸端粒酶，再加入磁珠吸附产物，利用磁力架去除液体，最后加入TRAP PCR反应体系，与磁珠一起进行PCR反应。此方法可以完全去除蛋白质等杂质的影响，并且亲和素标记的磁珠与用生物素标记目标产物有着超高的亲和力，可以保证提取的效率。

技术领域

本发明涉及检测方法，尤其涉及一种在液体活检中检测端粒酶活性的方法。

背景技术

端粒(Telomere)是真核细胞染色体末端的特殊结构。人端粒是由6个碱基重复序列(TTAGGG)和结合蛋白组成。端粒有重要的生物学功能，可稳定染色体的功能，防止染色体DNA降解、末端融合，保护染色体结构。正常细胞由于线性DNA末端复制问题，随体细胞不断增殖，端粒逐渐缩短。当细胞端粒缩至一定程度，细胞停止分裂，进入衰老阶段。故有人称端粒为正常细胞的“分裂钟”(Mistosis clock)，端粒长短和稳定性决定了细胞寿命，并与细胞衰老和癌变密切相关。

端粒酶(Telomerase)属逆转录酶，由RNA及蛋白质组成。端粒酶以RNA为模板在染色体末端添加端粒序列，以此维持端粒长度，目前对端粒酶的检测方法皆基于此特性。人类细胞端粒酶首先被美国加州大学的分子生物学教授Morin(1989年)在人宫颈癌细胞株HeLa细胞中发现。Dr.Woodring Wright和Jerry Shay证实90％的肿瘤细胞具有端粒酶活性，正常体细胞中不具有端粒酶活性。

最早的端粒酶活性检测方法为端粒重复序列延伸法，该方法灵敏度低，检测时间长，检测所需样品量大，但检测中放射性同位素用量较高，易污染环境。常用的端粒酶活性检测方法还包括端粒重复序列扩增法和杂交保护法等，前一种方法灵敏度高，操作简单，但是依靠样本质量，蛋白过多，会影响实验结果：后一种方法虽然特异性好、灵敏度高，但需要用到特殊仪器，且所需探针难以获取，因而不易推广。

在泌尿及生殖系统癌症领域，由于患者的尿液中含有脱落细胞，对新鲜尿液中细胞的端粒酶的检测，可以对泌尿及生殖系统癌症的早筛及预后起到参考作用。这作为一种无创检查手段，对泌尿及生殖系统癌症的的早筛及预后有着重要意义。

发明内容

本发明是为了解决上述不足，提供了一种在液体活检中检测端粒酶活性的方法。在癌细胞筛选完毕后，液体中会残留体液中的蛋白质等复杂组份，会对后续的TRAP(TRAP即端粒重复序列扩增法)实验产生影响，本发明的方法在筛选癌细胞完毕后，利用亲和素标记的磁珠吸附用生物素标记已经延伸好的产物，从而达到去除液体中蛋白质等其他杂质的影响。

本发明的上述目的通过以下的技术方案来实现：一种在液体活检中检测端粒酶活性的方法，包括以下步骤：

(1)尿液样本预处理，并且使用负向筛选法去除免疫细胞和单核细胞后，在筛选后的1.5mlEP管中加入200ul混合液(200ul 1x trap buffer、10ng bio-TS、1ul dNTPs、0.5U/ul RII)，biotin-TS的序列为5’-biotin-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3’；

(2)将1.5mlEP管放入超声破碎仪中，超声破碎细胞；

(3)破碎完成后，将1.5mlEP管放入30摄氏度水浴锅中孵育30min，使端粒酶引物发生延伸反应，端粒酶会结合TS引物末端的GTT合成AGGGTTA,然后每经过一次转位合成一个GGTTAG的6个碱基重复序列；

(4)1.5mlEP管中加入10ul亲和素标记的磁珠，旋转孵育10min，使得磁珠吸附上一步的延伸产物；

(5)使用磁力架吸附磁珠去除管中清液，保留磁珠；