[发明专利]可用于细胞内磁共振研究的DO3A型高稳定顺磁探针及制备方法

说明书

本发明提供一种可用于细胞内磁共振研究的DO3A型高稳定顺磁探针T₁及其制备方法。所述顺磁探针T₁的结构式如下：该顺磁探针可与蛋白质的特定位点进行选择性连接。其具有以下优点：a.对巯基具有高度化学反应选择性；b.电中性，对大分子影响小；c.水溶性好、配位点多、稳定性强、齿合度高并且与稀土离子形成的配合物具有动力学惰性；d.与蛋白的反应活性高；e.刚性强，对大分子固定作用好；f.探针与蛋白质通过稳定的硫醚键连接，可以进行细胞内测量。这些优点使其成为蛋白质细胞内磁共振研究的一个重要的工具。

技术领域

本发明属于化学生物学、细胞生物学和结构生物学领域中的高性能磁探针，即一种以(2,2',2”-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三)三乙酸为骨架以苯砜基为离去基团的蛋白质定点特异性修饰新型顺磁探针。

背景技术

蛋白质的空间结构、动态变化与其生物功能密切相关。通过磁共振方法可以研究蛋白质动态结构与相互作用，并在原子分辨率水平上深层次了解其结构-功能的关系。磁共振研究蛋白质通常需要定点的标记技术，在蛋白质特定位点引入顺磁探针，以此开展顺磁探针中顺磁中心与蛋白质中原子核的作用或者顺磁中心-顺磁中心的距离变化关系。因此蛋白质定点引入顺磁中心需要借助高活性、高选择性的标记化学反应和高性能的顺磁探针。

顺磁探针的质量对利用磁技术研究生物大分子的结构与动态学关系起着决定性的作用。顺磁探针一般均是一些具有双功能团的小分子探针，一端用于顺磁金属离子的螯合，另一端则用于与蛋白质连接。将顺磁探针与生物大分子连接后，利用顺磁效应可以揭示生物大分子的作用机制和作用构象变化、小分子与大分子作用的高分辨结构(参见：J.Biomol.NMR,2010,46:101-112)，这将对有效药物先导分子进行筛选与优化起到重要的导向作用。

评价一个顺磁探针的优劣通常需要考虑以下要素：a.配位稳定性。若标签与顺磁金属离子配位不稳定，则PRE(顺磁弛豫增强)和EPR(电子自旋共振)中会产生很多副作用。b.刚性。当标签刚性小时，顺磁标签和蛋白质的相对位置会发生变化，导致测得的EPR数据分辨率很差。c.与蛋白质的反应活性。如果反应活性太低，则反应时间会很长，或者需要比较苛刻的反应条件，这会对蛋白质造成非常不利的影响。d.标签与蛋白连接物的稳定性。细胞内环境复杂，还原性较高，若连接物不稳定，探针将会从蛋白质上面解离。e.探针不能带正电荷，否则会对研究不利。

Su等(Chembiochem,2006,7:1599–1604.)首先用Ellman’s试剂5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)活化蛋白质的巯基形成二硫键，过量的DTNB通过透析除去；之后加入等量的标签，标签中的巯基即和活化的二硫键反应生成新的二硫键，最终把多肽标签和蛋白质连接起来(反应过程见图1)。离去的5-巯基-2-硝基苯甲酸(TNB)呈现明显黄色，这为反应过程的检测提供了很大的便利。这种标记方法产率较高(>70％)，因为LBT多肽标签酸性很强，与蛋白质连接之后其pI值会明显改变，所以可以通过离子交换色谱柱将连接产物和未连接蛋白质分离。然而，二硫键不稳定，这阻碍了此类标签的广泛应用。

Prudencio等(Chem.Eur.J.,2004,10(3):3252～3260.)报道了具有两个活性巯基的化合物L-1(见图2)，其由DTPA双酸酐和S-(2-氨乙基)甲烷硫代磺酸反应得到，合成方法简单。此标签可以和蛋白质上距离的两个半胱氨酸残基同时反应，形成两个二硫键，增加了标签的刚性，限制了标签相对于蛋白质的运动。由于和上面相同的原因，即二硫键不稳定，该标签的应用范围大大受限。

Li等(Chem.Commun.,2012,48:2704–2706.)首次报道了利用末端烯键与蛋白质侧链巯基的迈克尔加成反应将化合物L-2(见图2)定点标记到蛋白质上，加成产物为硫醚，它可以在还原性环境和碱性条件下稳定存在。然而化合物L-2只有三个配位点，配位不稳定，镧系金属离子和其配位以后，还能结合其他配位原子。另外，此标签刚性很差。