[发明专利]小鼠胎肝基质细胞构建方法及其在造血辅助中的应用

权利要求书

1.一种小鼠胎肝基质细胞构建方法，其特征在于，按照如下步骤进行：

(1)胎肝基质细胞获取及体外培养

颈椎脱臼处死孕鼠，无菌条件下取出胎肝并吹打为细胞悬液，过25-35μm滤网制备单细胞悬液，用淋巴细胞分离液分离胎肝单个核细胞，按照0.5*10⁶-2*10⁶/cm²的密度接种于培养皿中的培养液上，置于37℃，5％CO₂浓度培养箱中培养，接种20-28h后初次换液，此后每2-3天换液，当细胞汇聚程度达78-82％时按照1:2传代培养。

(2)骨髓LK细胞分离

将雌鼠经颈椎脱臼处死，无菌条件下取出胫骨及股骨，冲出骨髓细胞，过25-35μm滤网制备单细胞悬液，再用淋巴细胞分离液分离得到骨髓单个核细胞，此后按照磁珠分选试剂盒操作流程分离出Lin^-c-Kit⁺细胞，细胞计数后置于4℃备用；

(3)细胞骨髓腔内移植

取1％戊巴比妥钠溶液麻醉小鼠后剪开膝关节处皮肤，用0.5-2mL注射器从开口处刺入胫骨骨髓腔，拔出针头，再用20-30μL进样器吸取细胞悬液从刚刚的针孔处插入骨髓腔并注入细胞，注射骨髓LK细胞和胎肝基质细胞，培养6-12周。

2.根据权利要求1所述小鼠胎肝基质细胞构建方法，其特征在于，所述培养皿中的培养液为高糖DMEM，15％胎牛血清(v/v)，1％青/链霉素(v/v)和0.1mMβ-巯基乙醇。

3.根据权利要求1所述小鼠胎肝基质细胞构建方法，其特征在于，步骤(3)所述骨髓LK细胞的注射量为1.7*10⁴个，胎肝基质细胞的注射量为2.3*10⁵个。

4.根据权利要求1-3所述小鼠胎肝基质细胞构建方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)所述滤网孔径大小为30μm。

5.根据权利要求1所述小鼠胎肝基质细胞构建方法，其特征在于，步骤(3)所述注射器为1mL注射器，进样器为25μL进样器。

6.权利要求1制备的小鼠胎肝基质细胞在造血辅助中的应用。