[发明专利]一种基于southern blot的端粒长度检测方法

说明书

本发明公开了一种基于Southern Blot的端粒长度检测方法，所述方法包含步骤：(a)从血液中提取人类基因组DNA，并配置酶切体系，反应条件为37℃水浴孵育16h，(b)将DNA酶切样本放入0.7％琼脂糖凝胶中电泳，反应条件为电压1.5V/cm，时间16h，反应过后修整琼脂糖凝胶，将其放置在干胶仪上，温度50℃，干燥1‑2h，涉及生物技术领域。该基于Southern Blot的端粒长度检测方法，避免了转膜效率对实验结果的影响以及克服了转膜对于DNA片段大小的限制，并且实验多步骤都在同一块凝胶上进行，使得实验操作连贯，实验结果稳定性高。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体为一种基于Southern Blot的端粒长度检测方法。

背景技术

端粒(telomere)是染色体末端的特定结构，具有防止染色体相互重组、融合以及保护染色体不被核酸酶降解等功能。人类染色体端粒是由数千个TTAGGG的短重复序列组成，总长度一般为5-20kb，但由于DNA复制的原因，细胞每分裂一次，端粒就缩短150bp左右。当端粒缩短到一定程度，细胞将无法继续分裂并进入衰老阶段。为避免这种因为DNA复制而引起的衰老，在一些特定的人体细胞如造血干细胞和生殖细胞内，利用一种被称作端粒酶(telomerase)的成分来延伸端粒序列，使其保持一定长度，从而获得持续分裂的能力。端粒酶是一种核糖核蛋白酶，主要由RNA(telomeraseRNA component，hTERC)和具有逆转录酶功能的酶(telomerase reverse transcriptase，hTERT)组成，此外还包括一些端粒酶相关蛋白(Dyskerin、NHP2、N0P10、TCABl等)，hTERT能以自身的RNA为模板合成端粒DNA，从而维持端粒长度。因此，对于快速分裂的细胞，其端粒长度处在端粒缩短(正常细胞分裂引起)和端粒增加(端粒酶执行)的动态平衡过程中。但是，在人体出生以后，只有在神经细胞、骨髓干细胞以及生殖细胞中存在端粒酶，而在正常的体细胞内则没有端粒酶表达，因此体细胞在增殖到一定程度就会进入衰老状态，然后由存在于骨髓等处的干细胞增殖分化为新的体细胞补充，完成体细胞的增殖代谢；尽管人体细胞如造血干细胞和生殖细胞内存在端粒酶，但其增加端粒的效能远远抵不上端粒变短的速度，因此随着年龄的增长，端粒逐渐变短，这也可以解释为什么人会逐渐衰老死亡。大量的动物实验以及临床观察证实，端粒缩短至一定程度，机体往往会罹患一些疾病，如癌症(前列腺癌、胰腺癌、乳腺癌)、恶性血液病(再生障碍性贫血、先天性角化不良、MDS、以及骨髓衰竭等)以及心脑血管系统疾病等。如在一些恶性血液病如再生障碍性贫血病人中，由于存在于端粒酶上的一些突变导致了端粒酶活性下降，导致端粒长度变短，从而导致再生障碍性贫血，最终往往因为骨髓衰竭而死亡。因此，端粒长度已被认为是一个重要的人体机能指标，是重要的“有丝分裂钟”或“分子钟”，端粒的缩短被认为与细胞衰老和癌症等疾病的发生密切相关，因此建立一种通用的高通量端粒长度检测方法，对于预防衰老和癌症都会起到很大的帮助。

自上个世纪80年代开始，学者们就开始研究如何进行端粒长度的测定，并陆续建立起了一系列端粒长度的检测方法，如Southern Blot，FISH，q-FISH，Flow-FISH和Q-PCR。在这些方法中Southern blot比较直观，因此被认为是检测端粒长度的“金标准”检测方法，该技术的原理是将基因组DNA经限制性内切酶酶解、琼脂糖凝胶电泳分离，使DNA片段按分子量大小排列在琼脂糖凝胶上。经碱处理凝胶使DNA变性(使双链DNA变成单链)，通过具有一定盐离子浓度溶液的虹吸作用，将凝胶中变性的单链DNA片段原位地吸印到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，经过干燥或紫外线照射处理。单链DNA片段的极性基团与支持膜上的基团结合而使DNA分子牢牢地固定到转移膜上，转移后的单链DNA分子与32P或35S标记的DNA探针按互补原理进行杂交。经放射自显影对特定位置上显现的特异DNA片段进行分析。

但是该方法也有一些缺点：