[发明专利]牙龈卟啉单胞菌诱导巨噬细胞外泌体RNA表达研究方法

说明书

本发明的牙龈卟啉单胞菌诱导巨噬细胞外泌体RNA表达研究方法，步骤包括：1)将人单核细胞U937依次进行复苏、培养及诱导，获得巨噬细胞；2)将细菌P.gingivalis W83复苏；3)构建P.gingivalis W83感染巨噬细胞的体外炎症模型；4)分别提取P.gingivalis W83感染巨噬细胞前后释放的外泌体并进行鉴定；5)分别提取P.gingivalis W83感染巨噬细胞前后释放的外泌体总RNA，进行全转录组的高通量测序，筛选差异表达的mRNA、lncRNA、circRNA，进行整合分析。本发明首次研究了巨噬细胞在被牙龈卟啉单胞菌感染的模拟炎症过程中分泌的外泌体内RNA表达的变化，根据实验结果可为外泌体在牙周致病和免疫过程的进一步研究奠定良好的基础。

技术领域

本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonasgingivalis，P.gingivalis)诱导巨噬细胞外泌体RNA表达研究方法。

背景技术

牙周炎(periodontitis)是一种以牙菌斑为始发因子、P.gingivalis为主要致病菌的发生在牙周支持组织的慢性破坏性、炎症性疾病^[1]。其中P.gingivalis是一种革兰式阴性短杆菌，产黑色素并且专性厌氧，属于红色复合体的一员。P.gingivalis对牙周支持组织的破坏与其外膜结构密切相关，菌毛(fimbriae)、脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)、红细胞凝集素(hemagglutinin，HA)、蛋白酶(牙龈素，gingipains)是P.gingivalis表面最重要的致病因子^[2]，均可被巨噬细胞识别，刺激巨噬细胞后使其合成并分泌多种促炎性细胞因子，细胞受损导致牙周组织损伤和破坏。有学者在研究心血管疾病时发现，革兰氏阴性菌表面的LPS刺激巨噬细胞可使其分泌具有特殊功能的外泌体，在机体免疫过程中发挥有效的免疫刺激作用^[3]。所以巨噬细胞作为P.gingivalis致病过程中主要的炎症细胞之一，研究外泌体是否参与它所涉及的免疫活动及机制对于牙周病的临床诊疗具有重要意义。

外泌体(exosomes)是一种具有表面特殊蛋白标志物和独特脂质、经过细胞“内吞-融合-外排”等活动过程形成的磷脂双分子层膜性囊泡结构。它大小均一，直径为40～150nm，密度为1.10～1.18g/mL。经研究，外泌体可以去除细胞生长过程中的废弃蛋白、在细胞间传递生物信息、提呈抗原从而激活T细胞、参与机体免疫炎症反应过程、血管的新生及肿瘤细胞的生长等等。目前在树突状细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、间充质干细胞和肿瘤细胞等不同细胞类型，以及大多数体液如外周血、尿液、唾液、腹水、关节液等都可以检测到来源广泛的外泌体^[4]。外泌体的组成成分有：丰富的胆固醇、鞘磷脂、微管蛋白、肌动蛋白、结合蛋白、四跨膜蛋白、各种mRNA、miRNA及siRNA等^[5]。其中外泌体携带的某些特异性蛋白可反映其生物起源和细胞来源，可做为外泌体鉴定的标志甚至临床诊断的指标之一。外泌体可以在细胞间传递信号物质来介导信息交流，国内外学者在研究中发现它跟心脑血管、肝脏、肾脏等系统疾病和肿瘤的发生、发展及损伤修复方面有密切的联系。

参考文献：

[1]Sudhakar U，Thyagarajan R，Jeyapal B，et al.Indagation of serum andsalivary reactive oxygen metabolite and cortisol levels in chronicperiodontitis and stress-induced chronic periodontitis patients[J].J IndianSoc Periodontol，2017，21(5)：371-5.