[发明专利]一种橙黄玉凤兰内生真菌的分离培养方法

权利要求书

1.一种橙黄玉凤兰内生真菌的分离培养方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）取橙黄玉凤兰植株，冲洗干净植物表面的沙土，用滤纸吸干植株表面的水分，置于有滤纸的干净培养皿中自然风干，然后转移至超净工作台；

（2）将风干后的植株分解为主茎、叶片、根和块茎，并剪切成3～4cm长的小段；

（3）将剪切后的小段用质量分数为65%-75%的乙醇浸泡处理1～3min；

（4）将乙醇浸泡后的小段取出，再用质量分数为2%-3%的次氯酸钠浸泡处理1～2min；

（5）将次氯酸钠浸泡后的小段取出，置于无菌吸水纸上吸干水分；

（6）将吸干水分后的根块分为面积为0.5～1.0cm²的小薄片，主茎和块茎剪成0.5～1.0cm长的小段，叶片切成面积为0.5～1.0cm²的小片，然后分别接种于含20-30μg/mL硫酸链霉素的PDA培养基中；

（7）将接种后的PDA培养基置于27-29℃恒温培养箱中，培养。

2.根据权利要求1所述的一种橙黄玉凤兰内生真菌的分离培养方法，其特征在于：所述步骤（7）之后还包括步骤（8）内生真菌的纯化培养：当发现从组织块中长出菌丝体时，采用尖端菌丝挑取法，立即把菌丝体转移到纯化培养基平板上进行纯化培养，直到得到纯净无污染的菌落。

3.根据权利要求2所述的一种橙黄玉凤兰内生真菌的分离培养方法，其特征在于：所述步骤（8）之后还包括步骤（9）内生真菌的形态学鉴定：将分离纯化得到的菌种在分离培养基上培养数日后，通过肉眼观察菌落形态进行真菌菌落形态观察并记录；然后采用直接挑取制片法，在显微镜下进行真菌形态观察，根据菌核的特征及结构，孢子着生部位及形态、大小、排列方式和有无隔膜显微特征，进行初步鉴定。

4.根据权利要求2所述的一种橙黄玉凤兰内生真菌的分离培养方法，其特征在于：所述步骤（8）之后还包括步骤（10）对橙黄玉凤兰内生真菌进行PCR鉴定，具体包括如下步骤：

A、菌株的培养：取橙黄玉凤兰内生真菌的菌丝进行培养；

B、DNA提取：采用CTAB法提取菌体DNA；

C、电泳检测：将提取的样品DNA进行电泳检测；

D、PCR扩增：将提取的样品DNA和设计好的引物配制成PCR反应体系，进行PCR扩增；

E、电泳检测：对PCR扩增产物进行电泳检测；

F、序列分析：将条带清晰、检测合格的PCR扩增产物进行测序，并进行序列分析。

5.根据权利要求4所述的一种橙黄玉凤兰内生真菌的分离培养方法，其特征在于：所述步骤A具体为：用无菌接种针挑取橙黄玉凤兰内生真菌的菌丝于盛有4-6mLPDB培养基的摇菌管中，于27-29℃、140-160rpm条件下振荡培养5～7d。