[发明专利]一种亲水性壳聚糖整体材料及其制备和应用

说明书

本发明涉及一种冷冻干燥法(freeze‑drying)制备壳聚糖亲水大孔整体材料及其应用。具体制备过程是以壳聚糖为单体、以聚乙二醇二缩水甘油醚为交联剂、以乙酸溶液为溶剂，通过冷冻干燥法制备成壳聚糖亲水整体材料。本发明所述的整体材料成本低廉绿色环保，对复杂样品中的糖肽具有良好的特异性吸附效果，在糖蛋白质组学研究中具有较强的应用潜力。

技术领域

本发明属于糖蛋白组学领域，具体涉及一种冷冻干燥法制备壳聚糖亲水性整体材料的制备和应用，该亲水性整体材料可用于标准蛋白质和复杂生物样品中糖肽的亲水色谱富集。

背景技术

蛋白质糖基化是最重要的翻译后修饰之一，蛋白质糖基化是指蛋白质在酶的作用下被连接上糖链的过程，在很多重要的生物学过程中起着关键的调节作用(文献1.Helenius et.al“Intracellular functions of N-linked glycans”.Science,2001,291:2364-2369.)。蛋白质的糖基化极大地增加了蛋白质的多样性和复杂性，也赋予了糖蛋白更多的生物学功能和更重要的生物学意义。糖基化异常与人类多种疾病密切相关(文献2.Couldrey et.al“Metastases:the glycan connection”Breast Cancer Research,2000,2:321-323.文献3.Drake et.al“Sweetening the pot:adding glycosylation tothe biomarker discovery equation”Clinical Chemistry,2010,56:223-236.)，因此糖蛋白的分析和鉴定对疾病的诊断和治疗具有重要指导意义(文献4.Kolarich et.al“Determination of site-specific glycan heterogeneity on glycoproteins”NatProtoc,2012,7:1285-1298.)。虽然目前的蛋白质组学技术已经很容易实现大规模地鉴定蛋白质，但从复杂样品中直接分析糖蛋白仍然困难。由于糖肽在总肽段混合物中占的比率很低(2-5％)，糖肽的信号强度一般较非糖肽更低，容易被非糖肽抑制，而且糖基化位点上的糖链结构具有较基因和蛋白质更高的多样性。因此在研究糖蛋白质组时，对糖肽进行高选择性富集非常必要。目前，常见的富集方法主要有亲水作用色谱法(HILIC)、凝集素亲和色谱法、肼化学法和硼酸亲和色谱法。

HILIC是使用极性固定相和以水-水溶性有机溶剂的混合物为流动相的弱极性流动相的正相色谱(文献5.Alpert et.al“Hydrophilic-interaction chromatography forthe separation of peptides,nucleic acids and other polar compounds”Journal ofChromatography A,1990,499:177-196.)。在分离过程中，分析物中的亲水成分会富集在固定相周围的富水层中，而疏水成分则留在流动相中。HILIC富集糖肽是利用糖肽相对于非糖肽更强的亲水性而容易被保留在极性固定相上。目前，许多HILIC材料已被成功应用于糖蛋白组学领域。

发明内容

本发明采用冷冻干燥法以稀乙酸为溶剂，壳聚糖为原料，聚乙二醇二缩水甘油醚为交联剂，真空冷冻干燥后得到壳聚糖亲水大孔整体材料，再通过加热交联使材料无法在1％TFA乙腈水溶液中溶解。

所述整体材料通过冷冻干燥法制备，通过聚乙二醇二缩水甘油醚，其结构为蜂窝状的疏松整块材料，其孔隙率按计算得所制备材料的孔隙率在95％以上，孔径经SEM扫描电镜观察5-20um。

具体包括如下内容：

配制含有壳聚糖和聚乙二醇二缩水甘油醚的稀乙酸溶液，将混合溶液超声除去气泡后置于液氮(-196℃)中冷冻，充分冷冻后经真空冷冻干燥机制备成壳聚糖亲水大孔整体材料，再将所得整体材料置于烘箱中加热使之交联。