[发明专利]重组酵母菌催化合成莱鲍迪苷M的方法

说明书

本发明涉及重组酵母菌催化合成莱鲍迪苷M的方法，属于食品添加剂技术领域。本发明解决的技术问题是提供一种转化率高的重组酵母菌催化合成莱鲍迪苷M的方法。该方法，以莱鲍迪苷A为底物，以重组酵母菌为催化剂，在蔗糖、氯化锌和柠檬酸三钠的存在下，催化底物进行反应，反应后，过滤，并加热滤液使重组微生物失活，得到粗制莱鲍迪苷M溶液，再进行纯化浓缩，得到莱鲍迪苷M；其中，所述重组酵母菌含有EUGT11编码基因和UGT76G1编码基因，且该重组酵母菌敲除了pgm基因、glgC基因和agp基因。本发明采用特定的重组酵母菌为催化剂，全细胞催化转化，方法简单，控制转化条件可以得到莱鲍迪苷M，其转化率高达90％以上。且采用本发明方法，无需加入UDP或UDPG，生产成本较低。

技术领域

本发明涉及一种重组酵母菌催化合成莱鲍迪苷M的方法，属于食品添加剂技术领域。

背景技术

甜味剂是指能赋予软饮料甜味的物质。目前，人们使用最多的天然甜味剂为蔗糖，蔗糖能够为人们提供甜味，其口感也被人们普遍接受，但是，蔗糖中的热量较高，糖尿病患者以及肥胖人群均需要在饮食中进行严格控制，因此，需要无热量或者低热量的代替蔗糖的甜味剂。

甜菊糖(steviol glycosides)是从甜叶菊(Stevia rehaudiana)叶片中提取分离得到的一类甜菊糖苷类化合物，具有高甜度(为蔗糖的250～300倍)、低热量(为蔗糖的1/300)，无毒副作用，无致癌物质，食用安全等优点，受到了科学界、产业界等多个领域的广泛重视，成为继甘蔗糖、甜菜糖之外的第三种具有开发价值和健康推崇的天然蔗糖替代品，被国际上誉为“世界第三糖源”。

甜菊糖苷类化合物组分众多，均具有四环二萜母核并且有不同程度的糖基化修饰及不同程度的甜味口感，目前，被识别的甜菊糖苷化合物主要有甜菊苷(Stevioside.ST)、莱鲍迪苷A(RA)、莱鲍迪苷C(RC)、莱鲍迪苷D(RD)、莱鲍迪苷M(RM)等，其中，仅甜菊苷和莱鲍迪苷A被商业化应用，广泛用于饮料、食品、调味剂、酒类、乳制品等食品加工领域。而其余的物质，比如莱鲍迪苷M，由于生产成本高，限制了其产业化的发展。

专利CN103757074A公开了一种酶法制备瑞鲍迪甙M的方法，该方法采用瑞鲍迪甙A或瑞鲍迪甙D为底物，在蔗糖、UDP的存在下，以重组细胞或者相应的重组细胞表达的酶为催化剂进行转化，得到瑞鲍迪甙M。但是，该方法需要额外加入价格昂贵的UDP，这无疑增加了成本，且采用该方法，以重组细胞为催化剂时，瑞鲍迪甙A的转化率较低，仅为40％以上，需要进一步的提高。

发明内容

本发明解决的技术问题是提供一种转化率高的重组酵母菌催化合成莱鲍迪苷M的方法。

本发明重组酵母菌催化合成莱鲍迪苷M的方法，以莱鲍迪苷A为底物，以重组酵母菌为催化剂，在蔗糖、氯化锌和柠檬酸三钠的存在下，催化底物进行反应，反应后，过滤，并加热滤液使重组微生物失活，得到粗制莱鲍迪苷M溶液，再进行纯化浓缩，得到莱鲍迪苷M；其中，重组酵母菌的菌体浓度OD600为80～120，莱鲍迪苷A浓度为1～80g/L；柠檬酸三钠浓度为50～80mmol/L，氯化锌浓度为0.5～2mmol/L，蔗糖浓度为30～50％(W/V)，pH值为7.5～8.5，所述重组酵母菌含有EUGT11编码基因和UGT76G1编码基因，且该重组酵母菌敲除了pgm基因、glgC基因和agp基因。

优选的，将该重组酵母菌的ushA基因替换为包含Basp和ugpA基因的T5操纵子。

优选的，反应温度为35～40℃，反应时间为20～60h。

作为优选方案，重组酵母菌的菌体浓度OD600为100，莱鲍迪苷A浓度为5g/L；柠檬酸三钠浓度为60mmol/L，氯化锌浓度为1mmol/L，蔗糖浓度为40％(W/V)，pH值为8.0。

作为优选方案，反应温度为37℃，反应时间为24h。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：