[发明专利]一种在杆状病毒表达系统中高效表达外源蛋白的方法及其应用

说明书

本发明提供了一种在杆状病毒表达系统中高效表达外源蛋白的方法，该方法通过在pFastbac Dual质粒中p10启动子和多角体启动子之后分别克隆外源蛋白基因，同时在p10启动子和多角体启动子之间插入同源重复序列，使得表达的外源蛋白量大大增加，表达的外源蛋白保持了其原有的免疫原性。本发明的表达外源蛋白的方法高效，低成本，能用于大量制备疫苗。

技术领域

本发明属于遗传工程领域，涉及杆状病毒高效表达外源蛋白的方法。

背景技术

杆状病毒是一类双链DNA病毒，自然界中主要感染鳞翅目、膜翅目和双翅目昆虫。杆状病毒基因组可以插入较大片段外源基因、表达外源蛋白，表达的外源蛋白具有较好的修饰加工，具有良好的生物学活性，至今已用杆状病毒表达的蛋白有千种，杆状病毒表达系统已被公认为是优良的表达系统。

然而，如何提高杆状病毒表达系统表达外源蛋白的表达量一直是国内外学者研究的方向，多数是通过改造杆状病毒来实现提高外源蛋白表达量。虽然经过改造的杆状病毒在一定程度上提高了外源蛋白的表达量，但是杆状病毒的改造都是针对具体外源基因来进行的特定改造，不适合其他的外源蛋白的高效表达，不具有通用性，当需要表达其他的外源基因时，还需要重新对其他的外源基因进行改造。因此，需要提供一种应用范围更广、针对不同蛋白的杆状病毒高效表达的方法。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种在杆状病毒表达系统中高效表达外源蛋白的方法，其中，所述方法包括：步骤(1)将AcMNPV基因组中同源重复序列插入AcMNPV的p10启动子(P_p10)和多角体启动子(P_PH)之间，获得之间插入了同源重复序列的P_p10和P_PH序列；步骤(2)将所述外源蛋白基因各一个拷贝分别插入到pFastbac Dual质粒中P_p10和P_PH之后，获得包含所述P_p10和外源蛋白基因、所述P_PH和外源蛋白基因双表达盒的pFastbac Dual质粒；步骤(3)将所述步骤(1)获得的之间插入了同源重复序列的P_p10和P_PH序列替换掉所述步骤(2)中所述pFastbac Dual质粒上的相邻的P_p10和P_PH，获得包含所述P_p10和外源蛋白基因、所述P_PH和外源蛋白基因的双表达盒及所述双表达盒之间插入了同源重复序列的质粒；步骤(4)将所述步骤(3)获得的包含双拷贝外源基因及同源重复序列的质粒转化DH10Bac感受态细胞，获得重组Bacmid质粒；步骤(5)将所述步骤(4)获得的所述重组Bacmid质粒转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒；以及步骤(6)培养所述步骤(5)得到的重组杆状病毒，收获上清，得到表达的所述外源蛋白。

本发明方法通过改造杆状病毒，使得外源蛋白高效表达，能显著提高外源蛋白的表达量，表达量能提高一倍或以上。且本发明方法可应用到多种外源蛋白的高效表达，具有广泛的适用范围。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述在杆状病毒表达系统中高效表达外源蛋白的方法中，所述步骤(1)中所述的同源重复序列为Hr3，Hr3为SEQ ID.No.7所示；或所述的同源重复序列为Hr1，Hr1为SEQ ID.No.8所示。

作为本发明的一种实施方式，本发明所述在杆状病毒表达系统中高效表达外源蛋白的方法中，所述步骤(1)中的所述之间插入了同源重复序列的P10和PH启动子的连续序列如SEQ ID.No.1或SEQ ID.No.2所示。