[发明专利]一种不依赖辅酶B12的甘油脱水酶基因及其应用

说明书

本发明提供了一种不依赖辅酶B12的甘油脱水酶基因及其应用，该基因可以利用S‑腺苷基甲硫氨酸作为辅因子催化甘油脱水，并对氧具有耐受性，该基因来源于Bacillus caseinilyticus、Vibrio diazotrophicus、Klebsiella oxytoca KCRI‑567C的甘油脱水酶，分别包括一个催化亚基和一个激活亚基；利用包含上述基因的重组微生物发酵生产1,3‑丙二醇等产物，发酵过程无需额外添加辅酶B12可以催化甘油的脱水，同时其对氧具有一定的耐受力，可以利用其在微氧或者厌氧的条件下生产1，3‑丙二醇，显著降低发酵生产成本。

技术领域

本发明属于基因工程和生物发酵技术领域，具体地说，本发明涉及一种不依赖辅酶B12、且具有一定氧耐受力的甘油脱水酶基因及其在发酵生产1,3-丙二醇中的应用。

背景技术

甘油脱水酶是一类特异性催化甘油或者1,2-丙二醇脱水生成3-羟基丙醛或者丙醛的脱水酶。甘油脱水酶是催化甘油合成1,3-丙二醇及3-羟基丙酸的第一个关键酶。甘油在甘油脱水酶的催化下首先生成3-羟基丙醛，后者在醇脱氢酶的作用下还原生成1,3-丙二醇，或者在醛脱氢酶的作用下氧化生成3-羟基丙酸。1，3-丙二醇是一种重要的化工原料，可作为有机溶剂应用于油墨、印染、涂料、润滑剂、抗冻剂等行业，其最主要的用途是作为聚酯和聚氨酯合成的单体，特别是与对苯二甲酸聚合生成聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)。PTT与PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)、PBT(聚对苯二甲酸丁二醇酯)相比具有更优良的性能，例如更好的耐污染性、韧性和回弹性以及抗紫外性能等，此外还具有耐磨、吸水性低、低静电等优点。因此PTT被认为是PET的升级产品，具有广阔的市场前景。

目前已知的甘油脱水酶主要包括两类，一类是辅酶B12-依赖型的甘油脱水酶，另一类是非辅酶B12-依赖型的甘油脱水酶。辅酶B12-依赖型的甘油脱水酶存在于克雷伯氏肺炎杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、鼠伤寒沙门氏菌等。目前已知的辅酶B12-依赖型的甘油脱水酶都有三个亚基组成，包括较大的α亚基，中等的β亚基，和较小的γ亚基，他们之间形成α2β2γ2的复合物结构。这一类辅酶B12-依赖型的甘油脱水酶会受到甘油以及氧的抑制。由于这类甘油脱水酶需要依靠辅酶B12，因此在异源微生物如大肠杆菌中表达这类酶并利用其发酵生产1，3-丙二醇或者3-羟基丙酸时需要添加昂贵的维生素B12，因此极大的提高了发酵的生产成本。非辅酶B12-依赖型的甘油脱水酶仅包含一个催化亚基dhaB1及激活亚基dhaB2，这类酶利用S-腺苷基甲硫氨酸(SAM)，由于大多数微生物都可以直接合成SAM，因此利用这类的甘油脱水酶无需添加昂贵的辅因子，从而可以降低发酵成本。但是，目前仅在丁酸梭菌(Clostridium butyricum)中报道存在非辅酶B12-依赖型的甘油脱水酶，然而由于该酶对氧具有极度的敏感性，少量的氧即可使其完全失活，因此发酵过程仅能在严格厌氧的条件下进行，限制了其广泛的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种生产成本低、无需添加昂贵的辅酶B12、对氧有一定耐受力的甘油脱水酶基因及其应用。

本发明提供一种不依赖辅酶B12的甘油脱水酶基因，所述甘油脱水酶基因来源于Bacillus caseinilyticus、Vibrio diazotrophicus或Klebsiella oxytoca KCRI-567C的甘油脱水酶，包括一个催化亚基dhaB1和一个激活亚基dhaB2。

(1)所述来源于Bacillus caseinilyticu的甘油脱水酶，其催化亚基dhaB1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，或如SEQ ID No.1所示氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸而不影响其生物活性的氨基酸序列；

其激活亚基dhaB2的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或如SEQ ID No.3所示氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸而不影响其生物活性的氨基酸序列。