[发明专利]一种构建番鸭呼肠孤病毒反向遗传系统的方法

说明书

本发明公开了一种构建番鸭呼肠孤病毒反向遗传系统的方法，通过从含有番鸭呼肠孤病毒细胞培养毒提取病毒基因组RNA，通过设计的特定引物，以病毒基因组RNA为模板RT‑PCR扩增MDRV全序列的基因分段，将目的基因分段进行酶切连接成MDRV10个基因片段，并与载体连接，挑取阳性菌落进行测序验证。将MDRV 10个片段的阳性质粒按比例混合共转染单层293T细胞。在细胞上传代到第15代后，细胞病变开始稳定，获得MDRV重组病毒。

技术领域

本发明涉及一种构建番鸭呼肠孤病毒（Muscovy duck reovirus，MDRV）反向遗传系统的方法。

背景技术

番鸭呼肠孤病毒病是由番鸭呼肠孤病毒(muscovy duck reovirus,MDRV)引起的，病鸭以软脚，肝和脾表面有大量灰白色坏死点，肾脏肿大、出血为主要特征的传染病，而且免疫器官严重受损呈现免疫抑制，并在水禽流感传播与流行过程中可能扮演带毒与储毒宿主的角色。因此，该病已成为目前严重威胁水禽养殖业的主要疫病之一。

根据第七次国际病毒分类委员会报告（2000年，Van Regenmortal等），番鸭呼肠孤病毒为呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属II亚群禽正呼肠孤病毒的成员。电镜下病毒粒子呈球形或近球形，直径60nm～80nm，正二十面体，立体对称、无囊膜，有可见的双层衣壳结构。

MDRV基因组为dsRNA，全长约为22,969 bp。聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明共有10个片段, 按其电泳率大小可分为三类：大片段（L1-L3）、中片段（M1-M3）和小片段（S1-S4），分别编码12个蛋白，即10个结构蛋白和2个非结构蛋白。S1基因全长1324bp,编码主要核心蛋白σA；S2基因全长1201bp,编码小非结构蛋白σNS；S3基因全长1191bp,编码主要外壳蛋白σB；S4基因全长1124bp, S4基因是个双顺反子，含有两个重叠的开放式阅读框（ORF），其中ORF1编码10.8kD的多肽P10，该多肽未发现任何潜在的跨膜区；而ORF2编码29.4kD的σC蛋白，编码的σC蛋白为小外壳蛋白，具有细胞粘附活性，可诱导型特异性中和抗体产生，在抵抗强毒攻击中起主要作用。M3基因全长1995bp，编码大非结构蛋白μNS；M2基因全长2155bp，编码主要外壳蛋白μB；M1基因全长2283bp，编码小核心蛋白μA。L1基因全长3959bp，L1基因编码λA蛋白;L2基因长3830bp，L2基因编码λB蛋白;L3基因长3907bp，编码λC蛋白。MDRV国内外分离株S基因同源性高，与传统的禽呼肠孤病毒(ARV)差异大，特别是σC 蛋白基因。MDRVMW9710株与ARV的σA 、σB、σNS 和σC 蛋白基因核苷酸同源性分别为76.0%～77.1%、60.3%～64.4%、78.4%～79.6%和2.7%～9.9%；而与法国MDRV89026 株σA、σB、σNS 和σC 基因的核苷酸同源性分别为90.0%、93.6%、87.9%～88.0%和93.1%。对MDRV M基因测序表明M1、M2、M3基因分别编码uA、uB、uNS蛋白，与ARV 同源性分别为 72.9%-73.9%、 67.15-69.6%和69.4%-70.8%。MDRV的非结构基因（NS）与法国89026株NS基因核苷酸同源性为87.8%，与ARV S1133的NS基因同源性为79%；进化树分析表明，MDRV与ARV形成不同的分支。

由于缺乏技术手段，无法开展MDRV基因组功能研究，导致相关研究停滞不前。而反向遗传系统是解决这一难题的有效手段。反向遗传学是指直接从生物的遗传物质入手来阐述生物生命发生的本质现象。通过这种系统可以研究人为修饰的目的基因对生物体的性状和表型的影响，从而进一步研究病毒基因结构、功能、病毒与宿主之间的相互作用。反向遗传技术推动了病毒基因组的人工操作和病毒基因功能的研究。因此，建立病毒反向遗传系统的研究具有十分重大的科学意义。因此构建MDRV反向遗传系统，分析相关基因在致病功能的作用，有助于阐明番鸭呼肠孤病毒关键基因或蛋白的功能，丰富呼肠孤病毒属病毒学的研究内涵，为番鸭呼肠孤病毒基因及表达蛋白的功能研究提供技术平台，为我国番鸭呼肠孤病毒病以及水禽其他病毒性传染病的防控奠定理论基础。

发明内容