[发明专利]一种RFFT1细胞的构建方法

权利要求书

1.一种RFFT1细胞的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：

S1)PBMC细胞负载致肿瘤突变的多肽，而后对负载多肽后的PBMC细胞进行一次多肽冲击；

S2)冲击后扩大培养，得到FF细胞；

S3)以致肿瘤突变的多肽作为抗原直接刺激所述FF细胞以筛选精准多肽；

S4)培养PBMC细胞，在培养过程中，用精准多肽进行多次多肽冲击；

S5)冲击后继续培养，得到RFF细胞；

S6)以精准多肽作为抗原刺激所得RFF细胞，筛选能够识别所述精准多肽的特异性细胞；

S7)通过测序得到所述特异性细胞的TCRβ链CDR3区序列，由所述TCRβ链CDR3区序列扩增得到TCR基因；

S8)培养PBMC细胞，敲除细胞中原有的TCR基因和表面免疫抑制性信号分子，并转入步骤S7中所得能够与精准多肽特异性结合的TCR基因，制备得到RFFT1细胞，所述免疫抑制性信号分子包括：PD-1、Tim-3、LAG3、CTLA-4、BTLA、VISTA、CD160、TIGIT、2B4(CD244)。

2.根据权利要求1所述的RFFT1细胞的构建方法，其特征在于，在步骤S2中，所述冲击后扩大培养得到FF细胞包括：

将多肽冲击后的PBMC细胞在预铺细胞刺激因子OKM-25的细胞培养装置中培养5天；

转移至含有培养液OKM-100+12％FBS的细胞培养装置中继续培养至第10天；

转移至含有培养液OKM-200+5％FBS的细胞培养装置中继续培养至第14～21天。

3.根据权利要求1所述的RFFT1细胞的构建方法，其特征在于，步骤S4中，重复多肽冲击3～4次。

4.根据权利要求3所述的RFFT1细胞的构建方法，其特征在于，在步骤S4中，每隔3～4天进行一次多肽冲击。

5.根据权利要求1所述的RFFT1细胞的构建方法，其特征在于，多肽冲击中，用浓度为10μg/mL～100μg/mL的多肽溶液进行多肽冲击。

6.根据权利要求1所述的RFFT1细胞的构建方法，其特征在于，所述致肿瘤突变的多肽由以下方法合成得到：

1)外显子测序

对肿瘤细胞进行全外显子测序；

将全外显子测序结果与正常细胞的基因组相比，筛选出突变的氨基酸位点；

2)抗原表位预测

以突变的氨基酸位点为中心，向两侧延伸10个氨基酸，将一段21个氨基酸的多肽作为潜在抗原表位；

IC50＜1000nM则认为此潜在抗原表位为抗原表位；

3)合成多肽

采用多肽固相合成法合成抗原表位肽。

7.根据权利要求6所述的RFFT1细胞的构建方法，其特征在于，所述肿瘤细胞来源于工程细胞系，所述工程细胞系包括H1299、H226、H358、H1563、H2228、A549、Renca、LLC小鼠Lewis肺癌细胞、CRL-6323B16F1、CRL-2539 4T1、U14小鼠子宫颈癌细胞、BV-2小鼠小胶质瘤细胞、G422小鼠神经胶质瘤细胞。

8.根据权利要求1所述的RFFT1细胞的构建方法，其特征在于，步骤S8中，用敲除原有TCR的CRISPR慢病毒载体和敲除表面免疫抑制性信号分子的CRISPR慢病毒载体去感染PBMC细胞，同时进行原有TCR的敲除以及免疫抑制性信号分子的去除；而后转入表达步骤S7所获得TCR基因的TCR基因表达载体，以转入步骤S7所获得的TCR基因。