[发明专利]一种维生素B12测定试剂盒及其制备方法

说明书

本发明属于生物分子化学发光检测技术领域，具体涉及一种维生素B12测定试剂盒及其制备方法。本发明所提供的一种维生素B12测定试剂盒的制备方法，包括：将磁珠与链霉亲和素反应，制备链霉亲和素包被的磁珠；将检测抗体偶联碱性磷酸酶，制备碱性磷酸酶标记的检测抗体；然后，采用有机磷酸酯类化合物对所述碱性磷酸酶标记的检测抗体进行磷酸化修饰，得到酶标记抗体复合物；将经过活化处理的生物素偶联维生素B12，制备生物素标记的维生素B12。通过上述制备方法制得的维生素B12测定试剂盒的稳定性显著提高。

技术领域

本发明属于生物分子化学发光检测技术领域，具体涉及一种维生素B12测定试剂盒及其制备方法。

背景技术

维生素B12(Vitamin B12，VB12)，又称氰钴胺素、钴胺素、外源因子、动物蛋白因子，是唯一含有矿物质的维生素，是维持人体正常代谢和机能不可缺少的一种微量营养素。维生素B12分子量1355，是一种含有3价钴的多环系化合物，4个还原的吡咯环连在一起变成为1个咕啉大环(与卟啉相似)，是维生素B12分子的核心，且含这种环的化合物一般被称为类咕啉。维生素B12为浅红色的针状结晶，易溶于水和乙醇，在pH4.5～5.0的弱酸条件下最稳定，在强酸(pH2)或碱性溶液中分解，遇热可有一定程度的破坏，但短时间的高温消毒损失小，遇强光或紫外线易被破坏。维生素B12是人体内一碳单位转移的重要辅助因子，故在诸多生化反应中都起到协同作用，是DNA合成过程中重要的辅酶，降低血浆中同型半胱氨酸水平等。若缺乏VB12，将影响人体对叶酸的利用，还可导致周围神经炎和儿童贫血。人VB12缺乏也是巨幼红细胞性贫血症的诱因，同时也与老年痴呆症、抑郁症以及冠心病等有关。

目前体外检测人体中VB12水平的方法主要包括酶联免疫法、化学发光法和液相色谱串联质谱法，化学发光法因其具有较高的灵敏度和特异性，检测快速，近年来深受国内外研究学者的重视，已逐渐成为国际主流的体外检测手段之一。

按检测原理，化学发光法可分为夹心法和竞争法，夹心法以磁性微粒为载体偶联抗体，利用磁珠被磁场吸引，在磁力作用下发生力学移动的特性，迅速捕捉到待测抗原。当加入样本后，样本的待测抗原，与磁珠上的抗体结合，此时再加入碱性磷酸酶(AP)标记检测抗体，形成“磁珠包被抗体-待测抗原-AP标记抗体”复合物，经洗涤去掉未结合的抗体后，加入AP的发光底物液，发光底物被复合物上的AP催化，持续稳定地发射出光子，发射出的光子被系统记录，通过软件将光子能量强度在标准曲线上转化为待测抗原的浓度。竞争法则以磁珠为载体包被抗原，当加入样本后，样本的待测抗原与磁珠偶联的抗原竞争性结合AP标记检测抗体，形成“磁珠包被抗原-AP标记抗体”复合物。

按发光原理，化学发光法可分为直接发光和酶促化学发光。酶促化学发光主要分为辣根过氧化物酶发光体系和碱性磷酸酶发光体系两种，辣根过氧化物酶发光体系的化学发光底物容易被氧化自身发光，本底相对较高，信噪比较低，影响因素复杂，结果较不稳定。碱性磷酸酶发光体系的化学发光底物达到平台期的时间长，背景发光低，信噪比高，反应不需要催化，体系简单，干扰因素少，检测成本低，故其能够克服上述缺点。然而，由于碱性磷酸酶在碱性的条件下稳定性较高，其标记的检测抗体在酸性环境下较为稳定，因而碱性磷酸酶标记的检测抗体容易受到所处环境的影响，导致酶标记物较低的稳定性，不但降低了产品有效期，且在使用过程中需频繁定标，增加了成本和未知风险。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种维生素B12测定试剂盒的制备方法，旨在解决现有技术制备得到的维生素B12测定试剂盒中的碱性磷酸酶容易受到环境影响，稳定性低等技术问题。

为了解决上述技术问题，一方面，本发明提供了一种维生素B12测定试剂盒的制备方法，包括：

将磁珠与链霉亲和素反应，制备链霉亲和素包被的磁珠；

将检测抗体偶联碱性磷酸酶，制备碱性磷酸酶标记的检测抗体；然后，采用有机磷酸酯类化合物对所述碱性磷酸酶标记的检测抗体进行磷酸化修饰，得到酶标记抗体复合物；