[发明专利]香坊肠杆菌ZJB-17001及其应用

说明书

本发明公开一株香坊肠杆菌ZJB‑17001及其应用，香坊肠杆菌ZJB‑17001催化2‑N‑苯乙酰基‑4‑[羟基(甲基)磷酰基]‑DL‑丁酸制备2‑氨基‑4‑[羟基(甲基)磷酰基]‑L‑丁酸转化率达到49.5％，e.e.％＝99.9％，催化N‑苯乙酰‑DL‑氨基酸制备L‑氨基酸转化率能达到49％，手性氨基酸可达到e.e.％＝99‑99.9％。

技术领域

本发明涉及一株产酰胺水解酶的菌株——香坊肠杆菌(Enterobacterxiangfangensis)ZJB-17001，及其在催化N-苯乙酰基氨基酸制备手性氨基酸与催化氨基酸衍生物的N-苯乙酰-DL-氨基酸衍生物制备N-苯乙酰-L-氨基酸衍生物中的应用。

背景技术

L-草铵膦化学名称为：4-[羟基(甲基)膦酰基]-L-高丙氨酸，是L-谷氨酸的一种结构类似物，能抑制谷氨酰胺合成酶(GS)活性，使植物体内氨积累，高浓度氨气积累阻断植物光呼吸作用，叶绿体结构的破坏以及基质的囊泡化，同时氨基酸合成受阻，导致细胞膜受损和细胞死亡，从而杀灭杂草。其具有广谱性，是世界第二大转基因作物耐受除草剂。

目前L-草铵膦合成方法有化学合成法和生物合成法。化学法主要通过以下4种方式构建L-草铵膦的手性中心：1)利用手性辅助试剂，手性诱导构建手性中心；2)以天然氨基酸为手性源，转化得到L-草铵膦；3)由手性催化剂催化的不对称合成反应；4)手性拆分外消旋体。但是化学法合成L-草铵膦工序多，收率较低，手性试剂成本高昂，且产生的三废量大，处理比较困难。生物法则具有严格的立体选择性，温和的反应条件、较高的收率和易于分离纯化等优势，因此，生物法生产L-草铵膦技术具有十分重要的产业化开发价值。

生物法生产L-草铵膦根据作用底物不同有蛋白酶水解双丙氨膦、通过磷酸二酯酶I、酰胺酶I和谷氨酰胺酶分步协同作用保持光学活性水解L-3-乙酰氨基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酰胺、α-胰凝乳蛋白酶的拆分双丙氨膦乙酯、脱乙酰基酶拆分N-乙酰-草铵膦、酰胺酶拆分2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酰胺、酯水解酶水解L-草铵膦-N-羧酸酐、腈水合酶水解草铵膦含腈底物、转氨酶催化2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸等。

目前应用于工业化的生产草铵膦的方法可以归结为：德国拜耳利用Michael加成法制备DL-草铵膦；Srecker法合成DL-草铵膦；明治制果不对称催化加氢合成L-草铵膦。其中Srecker法合成DL-草铵膦路线反应条件温和，是目前产业化大生产主要采用的路线。该路线以亚磷酸三乙酯和三氯化磷为原料，经歧化、格式、甲基化、加成、腈氨化、酸解、氨化反应制得DL-草铵膦。繁杂较长的合成路线产生大量“三废”，“三废”的处理也是整个合成工艺至关重要的因素。每生产一吨草铵膦原料，约产生废水60吨，大部分废水需蒸干出废渣，部分废渣、结晶脚料无法回收利用。含镁废水通常采用桶装外卖或是委托单位进行焚烧处理，不仅造成资源浪费，且污染环境。

目前合成L-草铵膦的化学方法主要有：1)手性辅助剂诱导法，以(S)-2-羟基-3-蒎酮为手性辅助剂制备，产率为51％，e.e.值为79％；以D-缬氨酸甲酯为手性辅助剂，需要-78℃低温反应，产率为51％，e.e.值为93.5％。2)天然氨基酸手性源法，以L谷氨酸为手性源，e.e.值为99.4％；L-蛋氨酸为手性源，总收率为42.3％，e.e.值为93.5％，需要用到剧毒碘甲烷。3)不对称合成法，不对称催化加氢——催化剂用量大且三甲基硅氰价格昂贵；不对称Strecker反应——用到剧毒氰化物；不对称Michael加成——催化剂用量大，且产品收率和e.e.值低。4)外消旋体拆分法，此方法最高收率86％，e.e.值最高99％，但拆分后D-草铵膦未转化，浪费原料。

用酰胺水解酶选择性催化拆分DL-草铵膦衍生化产物2-N-苯乙酰基-4-[羟基(甲基)磷酰基]丁酸制备L-草铵膦的重要有效成分2-氨基-4-[羟基(甲基)磷酰基]-L-丁酸，为实现工业化路线的L-草铵膦合成提供了依据。