[发明专利]降解酯酶基因，由其合成的工程菌及工程菌制备方法和应用

权利要求书

1.一种降解酯酶基因，其特征在于，所述降解酯酶基因为est3384基因，所述est3384基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种工程菌，其特征在于，所述工程菌由权利要求1所述的est3384基因和pGEX-3x载体连接得到重组载体转化至E coli DH5α中得到。

3.一种权利要求2所述工程菌的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、以est3384基因为模板，设计特异性引物，进行PCR扩增得到扩增产物；

S2、将所述扩增产物用限制性内切酶Bam H I和EcoRⅠ双酶切得到est3384基因的DNA片段；

S3、将所述DNA片段连接到pGEX-3x载体上得到重组载体；

S4、将所述重组载体转化至E.coli感受态细胞BL21中得到工程菌。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述S1步骤中，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；所述下游引物的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；

和/或，所述PCR扩增程序为：94℃预变性5min，94℃变性45s，61℃复性30s，72℃延伸60s，循环变性、复性和延伸步骤35次，72℃最后延伸10min。

5.一种权利要求2所述的工程菌在降解菊酯类农药中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用方法包括以下步骤：

(1)将所述工程菌在含有氨苄青霉素的LB培养基中培养至OD₆₀₀为0.6～0.7；

(2)加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷继续培养6～12h得到菌液；

(3)将所述菌液用裂解液裂解后煮沸，离心，收集上清液；

(4)提取所述上清液中的表达降解酯酶est3384的蛋白酶液，与磷酸缓冲液和农药混合得到混合液；

(5)将所述混合液进行孵育，完成菊酯类农药的降解。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述(2)步骤中，所述异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的浓度为0.5mM；

和/或，所述(4)步骤中，所述混合液中蛋白酶液的终浓度为10mg/L。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述(3)步骤中，所述裂解液的成分包括：50mM NaH₂PO₄、300mM NaCl、10mM imidazol、10μg/mL溶菌酶。

9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述(4)步骤中，所述混合液的pH为5.0～8.0。

10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述(5)步骤中，所述孵育的温度为35℃～55℃，所述孵育的时间为1h。