[发明专利]葡萄浆果内坏死病毒侵染性克隆及其构建方法

权利要求书

1.一种葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆的构建方法，包括如下步骤：将葡萄浆果内坏死病毒基因组全长cDNA第1-4978位所示的DNA片段和葡萄浆果内坏死病毒基因组全长cDNA第4962-7229位所示的DNA片段通过无缝克隆方式连接至植物表达载体中，得到含有葡萄浆果内坏死病毒全长cDNA的重组表达载体；所述重组表达载体即为葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆；

将葡萄浆果内坏死病毒基因组全长cDNA第1-4978位所示的DNA片段和葡萄浆果内坏死病毒基因组全长cDNA第4962-7229位所示的DNA片段通过无缝克隆方式连接至植物表达载体中的方法如下：

1)以葡萄浆果内坏死病毒的cDNA为模板，分别采用5'half1a/1b和3'half2a/2b进行PCR扩增，分别得到GINV 5'扩增片段和GINV 3'扩增片段；所述GINV 5'扩增片段为含有序列1第1-4978位所示的DNA分子；所述GINV 3'扩增片段为含有序列1第4962-7229位所示的DNA分子；

5'half1a：catttcatttggagaggcctGATAAGTAGTTGACAGTGATCAATTG；

5'half1b：agacatcaaAGGCCTCGTAATCAGATTC；

3’half2a：cgaggcctTTGATGTCTCACAGGACC；

3’half2b：ccatgccgacccggggatccT₍₄₀₎GGAAATTAATTAAAAC；其中“T₍₄₀₎”代表碱基T的个数为40；

2)用限制性内切酶Stu I和Sma I对pCB301-2x35S-HDV_RZ-NOS载体进行双酶切，得到双酶切后的载体；

3)利用无缝克隆试剂盒将所述双酶切的载体与所述GINV 5'扩增片段和所述GINV 3'扩增片段进行连接，得到所述重组表达载体；

所述葡萄浆果内坏死病毒基因组全长cDNA序列如序列表中序列1所示。

2.利用权利要求1所述方法制备得到的葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆。

3.含有权利要求2所述的葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆的重组菌。

4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为含有所述葡萄浆果内坏死病毒侵染性全长cDNA克隆的农杆菌。

5.权利要求2所述的葡萄浆果内坏死病毒侵染性克隆或权利要求3或4所述的重组菌在制备单一病毒侵染植物模型中的应用；所述单一病毒为葡萄浆果内坏死病毒。

6.权利要求2所述的葡萄浆果内坏死病毒侵染性克隆或权利要求3或4所述的重组菌在研究葡萄浆果内坏死病毒生物学特性和/或致病机理中的应用。

7.权利要求2所述的葡萄浆果内坏死病毒侵染性克隆或权利要求3或4所述的重组菌在研究葡萄浆果内坏死病毒与宿主植物互作中的应用。