[发明专利]一种宝华鹅耳枥ISSR-PCR分子标记体系

说明书

本发明属于遗传生物学技术领域，具体涉及宝华鹅耳枥ISSR‑PCR的分子标记体系。本发明提供如下优化的ISSR‑PCR反应体系：25µl反应体系中含有1*PCR缓冲液，2.5 mM的Mg²⁺，0.25 mM dNTPs，引物0.6µM，DNA模板50 ng，Taq酶1.2 U；上述反应体系的扩增程序：95℃预变性5 min，然后95℃变性30 sec，56℃退火45 sec，72℃延伸1 min，40个循环后72℃再延伸7 min，琼脂糖凝胶电泳检测。本发明提供的宝华鹅耳枥ISSR‑PCR体系稳定性好，产物条带清晰度高，多态性丰富。

技术领域

本发明属于遗传生物学技术领域，具体涉及宝华鹅耳枥ISSR-PCR分子标记方法。

背景技术

宝华鹅耳枥（Carpinus oblongifolia）是桦木科鹅耳枥属落叶乔木，仅分布在江苏省宝华山，现有野生植株数量十分稀少，被《中国生物多样性红色名录--高等植物卷》列为极危等级（CR）。然而，由于宝华鹅耳枥分类地位的不确定，研究工作长期遭到忽视，遗传多样性的表现层次未知，缺乏相应的濒危物种保护方案。

遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，是生态系统多样性和物种多样性的基础，具有从形态特征、细胞学特征、生理特征、基因位点和DNA序列等多层次的表现形式，其中DNA多样性是遗传多样性的本质。DNA分子标记是以个体间核苷酸差异为基础的遗传标记，是DNA水平上遗传变异的直接反映，能更准确的揭示种、变种、品种乃至无性系间的差异。DNA分子标记已被广泛应用于各种的动植物的品种鉴定、遗传图谱建立、遗传多样性等方面的研究。

ISSR（内部简单重复序列）技术是1994年加拿大蒙特利尔大学的Zeitkiewicz等创建的一项新型DNA分子标记技术，通过加锚定的微卫星寡核苷酸作引物，对两侧具有反向排列SSR的一段DNA序列进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳分离谱带的相对位置，来分析样品间的多态性。因其无需预先克隆和测序SSR两端的碱基序列即可进行扩增，极大减少多态性分析的实验成本，同时操作简单、重复性好、多态性高、物种间通用，尤其对缺乏分子遗传学研究背景的濒危动植物的遗传多样性水平评价中发挥重要作用，比如宝华鹅耳枥。

ISSR分子标记试验的关键在于对反应体系和反应条件的优化，不同材料来源的基因组DNA所采用的ISSR多态性引物不同，引物和退火温度以及相应的PCR体系所采用的不同商品型号的Mg²⁺浓度、dNTPs浓度和Taq酶等诸多因素均会影响试验结果。因此，开发宝华鹅耳枥的ISSR标记技术，建立科学合理的ISSR-PCR反应体系，寻求最佳的分子标记体系，可为后续遗传多样性分析奠定基础，为濒危物种的保护提供科学依据。

发明内容

1. 本发明的目的是提供一种宝华鹅耳枥ISSR-PCR分子标记体系及其应用，包括以下步骤：

1）提取宝华鹅耳枥的基因组DNA；

2）以宝华鹅耳枥基因组DNA 为模板进行ISSR-PCR扩增。

2. ISSR-PCR反应体系25 µl中含有1*PCR缓冲液，2.5 mM的Mg²⁺，0.25 mM dNTPs，引物0.6 µM，DNA模板50 ng，Taq酶1.2 U，此反应混合液按照：95℃预变性5 min，然后95℃变性30 sec、56℃退火45 sec、72℃延伸1 min，40个循环，72℃再延伸7 min，进行扩增。

3. 本发明优选的10条ISSR-PCR引物来自于加拿大蒙特利尔大学公布的100条引物，No1-10的具体序列如下：

No1 AGAGAGAGAGAGAGAGYC

No2 CACACACACACACACAG