[发明专利]一种利用毛乳头细胞外泌体治疗雄激素源性脱发的注射液的制备方法

权利要求书

1.一种利用毛乳头细胞外泌体治疗雄激素源性脱发的注射液的制备方法，其特征在于，所述注射液是在不含血清的基础培养基中获取的含毛乳头细胞外泌体的生理盐水溶剂，其制备方法包含以下步骤：

（1）毛乳头细胞的分离；

（2）毛乳头细胞的贴壁培养：将所述步骤（1）中获得的毛乳头细胞进行贴壁培养；

（3）毛乳头细胞的刺激诱导培养：当所述步骤（2）中贴壁培养获取的原代毛乳头细胞传至第三代时转入细胞培养系统，并在三气培养箱中培养，培养至第7天时，降低培养箱内氧气浓度为0.1～3%，同时加入终浓度为1 ~ 5*10⁻⁴ M的米诺地尔进行刺激诱导；刺激诱导24h后，移去所述步骤（2）的贴壁培养的培养基，并用不含血清的基础培养基清洗3次，换培养基为不含血清的基础培养基，更换氧气含量为5%；

（4）外泌体冻干粉的制备：所述步骤（3）中在不含血清的基础培养基中培养24 ~ 48 h后，收集细胞上清液，经过低温超速离心并用PBS溶解后获取毛乳头细胞外泌体；计数分装入安瓿瓶，放置于-50～-80℃的温度下进行冷冻处理，然后于-50℃冻干处理，得到毛乳头细胞外泌体冻干粉；

（5）注射液配置：所述毛乳头细胞外泌体冻干粉用生理盐水溶解为含毛乳头细胞外泌体的生理盐水溶剂。

2.根据权利要求1所述的利用毛乳头细胞外泌体治疗雄激素源性脱发的注射液的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中毛乳头细胞的分离包含以下步骤：

a. 经过手术后的单个毛囊置于毛囊采集液中于4℃环境保存，用含质量分数1% 的双抗PBS溶液清洗毛囊组织2～3次；

b. 显微镜下用1ml注射器针头将毛球部组织整个分离出来，将残留的毛母质清除干净，用移液枪将组织移至新的含PBS溶液的培养皿中；

c. 将PBS清洗一次后加入0.2% 胶原酶IV，在37℃温度下消化1～2 h，间隔10min观察消化状态，同时用吸管吹打组织，待有毛乳头组织周边的真皮鞘组织全部解离出来后，在显微镜下用移液枪挑选出单个毛乳头细胞，放置入一个新的培养皿中。

3.根据权利要求1所述的利用毛乳头细胞外泌体治疗雄激素源性脱发的注射液的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中毛乳头细胞在37℃、5%CO₂培养箱中进行贴壁培养，待组织全部贴壁并有细胞爬出后更换培养基，以后每间隔3天更换一次培养基，待细胞生长融合达到80%时进行传代培养。

4.根据权利要求1或3所述的利用毛乳头细胞外泌体治疗雄激素源性脱发的注射液的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中贴壁培养的培养基包含DMEM/F12、胎牛血清、EGF、bFGF和双抗。