[发明专利]一种猪蓝耳病灭活疫苗的制备方法

权利要求书

1.一种猪蓝耳病灭活疫苗的制备方法，包括以下步骤：

(1)培养液的配制：在MEM基础培养基中加入新生牛血清、中药提取液配制成培养液A和培养液B；

(2)细胞培养：将Marc-145细胞复苏后，接入到培养液A中进行培养，待Marc-145细胞长成单层后；从单层细胞中选择无污染、形态正常的Marc-145细胞接入到培养液B中继续培养，待细胞长到培养液表面的75％～80％时，即得Marc-145细胞培养液；

(3)病毒培养：将猪蓝耳病毒液接入到Marc-145细胞培养液中，继续培养至85％以上细胞出现CPE后，收获培养病毒液；

(4)纯化：将收获的病毒液采用中空纤维柱进行澄清、微滤、浓,80-100倍后，采用分子筛层析柱对滤液进行纯化；

(5)灭活：采用β-丙内酯灭活纯化的病毒液后，加入5％左右的中药提取液混合配置成灭活疫苗。

2.如权利要求1所述的猪蓝耳病灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的培养液A是在MEM基础培养基中加入10％的新生牛血清和15-20％的中药提取液。

3.如权利要求1所述的猪蓝耳病灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的培养液B是在MEM基础培养基中加入10％的新生牛血清和35-45％的中药提取液。

4.如权利要求1所述的猪蓝耳病灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的中药提取液按重量份计由10-15份茯苓、6-10份蒲公英、6-10份黄芪、3-5份艾草、10-15份玉米须、3-5份菟丝子、2-4份白术、2-4份刺五加、2-4份淫羊藿。

5.如权利要求4所述的猪蓝耳病疫苗的制备方法，其特征在于，所述的中药提取液的制备：按重量份配比分别称取茯苓、蒲公英、黄芪、艾草、玉米须、菟丝子、白术、刺五加、淫羊藿，并分别粉碎，然后混合制成药粉；向药粉中加入8倍水浸泡20-30min后,加热煎煮1-1.5h，过滤，得到滤液A和药渣；向药渣中加入5倍80％乙醇，加热到60-70℃，保持恒温30-40min，过滤，回收乙醇，得到滤液B；将滤液A和滤液B混合后，使用孔径为0.5-10μm的微孔滤膜过滤，灭菌，即得中药提取液。

6.如权利要求1所述的猪蓝耳病灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的猪蓝耳病毒液的制备：将患有猪蓝耳病的1月龄仔猪剖检，采集肺脏及血清，匀浆研磨后用MEM基础培养基配置成悬浮液，加双抗处理，1500rmp离心20min，取上清液经0.20μm的微孔滤膜除菌，即得猪蓝耳病毒液。

7.如权利要求1所述的猪蓝耳病灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的步骤(2)，培养温度为36-37℃。

8.如权利要求1所述的猪蓝耳病灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的Marc-145细胞培养液的细胞密度为6×10⁵/ml～8×10⁵/ml。

9.如权利要求1所述的猪蓝耳病灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述的步骤(3)，猪蓝病毒液的接入量为Marc-145细胞培养液体积的1-1.5％。