[发明专利]一种破囊壶菌高产DHA的单一葡萄糖碳源流加发酵培养基及其流加培养方法

权利要求书

1.一种破囊壶菌高产DHA的单一葡萄糖碳源流加发酵培养基及其流加方法，其特征在于：培养基成分及流加成分如下：

发酵培养基成分为葡萄糖40-60g/L、酵母提取物5-15g/L、磷酸二氢钾0.25g-1.0/L、海盐20-33g/L；流加液成分：葡萄糖浓度600-800g/L。

2.根据权利要求1所述一种破囊壶菌高产DHA的单一葡萄糖碳源流加发酵培养基及其流加方法，其特征在于：方法包括如下步骤：

（1）破囊壶菌发酵培养基制备：配置3L发酵培养基，搅拌并超声5-10分钟至完全溶解，装至5L发酵罐中，调节好发酵罐的pH及溶氧电极，进行密闭性及保压完成后，至灭菌锅，115℃灭菌21分钟，连接好冷却水管路，冷却至室温；

（2）破囊壶菌流加液制备：配置流加液300-400mL，玻璃棒搅拌并超声5-10分钟至完全溶解，可50-60摄氏度水浴，加速溶解，115℃灭菌21分钟，冷却至室温待用；

（3）菌种的活化：在超净台内，用灭菌的接种环从固体培养基上挑取破囊壶菌接种于通用培养基平板上三区划线，置 28℃培养箱中培养24～48h，得活化菌种；

（4）破囊壶菌种子液制备：

种子液培养基成分为：葡萄糖：20g/L、酵母提取物1g/L、蛋白胨1.5g/L、磷酸二氢钾0.25g/L、人工海盐33g/L，自然pH；配制好种子液后，装至1L锥形瓶，每个瓶子装300ml培养基；挑取一环活化菌种接种于种子液培养基中，将其放入条件为150rpm，28±1°C的摇床中培养24-48h；

（5）发酵罐发酵培养：

在无菌火环的保护下，将摇制的300ml种子液接种进发酵罐中，调节溶氧、温度，使溶氧保持在30%，温度保持在28℃，转速与溶氧保持关联，持续发酵培养；通过对发酵培养基中葡萄糖浓度测定，碳源消耗至一定量时，在36h-48h时，进行碳源的补加，即流加液流加50-100ml左右，此后，每隔一段时间进行流加一次，保持发酵培养基中碳源浓度稳定在一个范围内；根据培养周期进行流加，一般流加3-4次，培养4-5天；培养期间每24h进行取样检测；

（6）测定生物量干重；

（7）测定总油脂（TFA）、DHA产量。

3.根据权利要求2所述的一种破囊壶菌高产DHA的单一葡萄糖碳源流加发酵培养基及其流加方法，其特征在于：所述步骤（4）破壶囊菌种子液接种量为5%-10%。

4.根据权利要求2所述的一种破囊壶菌高产DHA的单一葡萄糖碳源流加发酵培养基及其流加方法，其特征在于：所述步骤（6）具体为：取出所述步骤（5）发酵液8-20ml，离心水洗后弃上清，将菌体冻干称重即可得到其发酵液中破囊壶菌生物量。

5.根据权利要求2所述的一种破囊壶菌高产DHA的单一葡萄糖碳源流加发酵培养基及其流加方法，其特征在于：所述步骤（7）具体为：

A、取冻干的菌体加入2ml的4%的H₂SO₄-甲醇；

B、100μl内标（1g/L十九烷酸），80°水浴1h后取出冷却；

C、加入1ml灭菌水，1ml正己烷，混匀后离心，取上层有机相，过0.45μm膜后气相测样，根据内标的量来计算出DHA的含量。