[发明专利]用于高加索三叶草PCR表达分析的内参基因及构建方法

说明书

本发明公开一种用于高加索三叶草PCR表达分析的内参基因及构建方法，内参基因其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示；构建方法，如下：利用高加索三叶草7个组织转录组数据，选择7个表达稳定的内参基因，同时选用在三叶草属中常用的1个传统内参基因作为对照；将上述候选内参基因进行引物设计，对每个cDNA进行常规PCR扩增，得到引物的扩增效率和扩增到达阈值的循环数；对获得的数据进行内参基因稳定性评估分析，最终筛选到特定试验条件下最合适的内参基因和内参基因数。该内参基因做参照物用于检测高加索三叶草基因表达水平变化，用于校正上样量和上样过程中存在的试验误差，保证实验结果的准确性。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于高加索三叶草PCR表达分析的内参基因及构建方法。

背景技术

基因表达分析广泛应用于生命科学领域,其研究的深入对探寻疾病相关基因和调控机理、揭示生命奥妙等方面至关重要。在转录水平进行基因表达定量中,如实时荧光定量PCR(Quantitative real-time RT-PCR,qRT-PCR)、RNA印迹(Northern blotting)、核糖核酸酶保护分析(ribonuclease protection assay,RPA)、基因芯片(gene chip)等,为获得更加准确可信的结果,都需要内参基因对目标基因的表达水平进行标准化衡量。

聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction，简称PCR技术)由于具有耗时短、特异强、灵敏高等特点，被广泛应用于基因表达的定量分析。由于PCR技术灵敏度高，容易出现假阳性、假阴性的检测结果，内参基因作为qPCR反应的内部参照，具有校准样品量和反转录效率的作用，提高试验数据的准确性。理想的内参基因应该是在所有样本中均表达稳定，因此，利用qRT-PCR对目标基因进行相对定量的准确性依赖于使用经过系统验证的、表达稳定的内参基因，从而排除PCR检测过程中可能出现的假阳性、假阴性结果。

高加索三叶草(Trifolium ambiguum Bieb.)是豆科三叶草属中唯一具有地下根蘖的多年生长寿命牧草，具有发达的地下根蘖，与同属的其它植物相比，具有较强的抗寒、抗旱和耐牧性。利用基因表达分析的方法挖掘高加索三叶草优异基因和调控网络，是进行三叶草属植物遗传改良的前提。目前三叶草属植物基因表达分析中使用的多是传统的内参基因，这些传统的内参基因并未经过系统验证，稳定性较差，导致三叶草属植物基因表达分析的准确性较差。现实中并不存在不同试验条件下都恒定表达的理想内参基因。尤其是在非生物胁迫条件下,随着环境的变化内参基因的稳定性也会受到不同程度影响。为了研宄高加索三叶草的不同组织、不同生长发育阶段及非生物胁迫条件下的功能基因表达，筛选特定条件下的最佳内参基因或基因组合是十分必要的。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于高加索三叶草PCR表达分析的内参基因及构建方法，该内参基因做参照物用于检测高加索三叶草基因表达水平变化，用于校正上样量和上样过程中存在的试验误差，保证实验结果的准确性。

本发明的目的通过如下技术实现：一种用于高加索三叶草PCR表达分析的内参基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。

本发明还具有如下技术特征：

1、一种用于高加索三叶草PCR表达分析的内参基因的构建方法，如下：

(1)利用高加索三叶草7个组织转录组数据，从中选择7个表达稳定的内参基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7,SEQ ID No.8所示，同时选用在三叶草属中常用的1个传统内参基因作为对照，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.5所示，共8种候选内参基因；

(2)将上述8种候选内参基因进行引物设计，对每个cDNA进行常规PCR扩增，得到引物的扩增效率和扩增到达阈值的循环数；