[发明专利]一种修复人体细胞的复合牦牛骨胶原蛋白肽粉

权利要求书

1.一种制备复合牦牛骨胶原蛋白肽粉的方法，该方法包括以下步骤：(1)将牦牛骨进行预处理；(2)将牦牛骨进行脱脂处理；(3)将牦牛骨进行脱矿物处理；(4)提取胶原蛋白；(5)纯化胶原蛋白；(6)将胶原蛋白进行酶解；和(7)将胶原蛋白多肽进行纯化；

步骤（1）将牦牛骨进行预处理包括：将新鲜的牦牛骨去除骨膜，剔除残留的残肉、脂肪、筋膜、骨髓和其它非骨骼组织，用0.5-2.0wt%浓度H₂O₂溶液浸泡1-5h，再用生理盐水冲洗以洗去残留的杂质，然后锯切成5mm-15mm的小块；

酶解时，酶为BSC酶和胰蛋白酶的组合，BSC酶和胰蛋白酶的用量比例为1:2-2:1，以酶单位之比计，所述BSC酶通过以下方法制得：(a)将蜡样芽孢杆菌即Bacillus cereusMBL13-U以4mL/100mL的接种量接种于pH 6.4的发酵培养基中，在35℃，160r/min的条件下反应46h，以12000g离心力在4℃下高速离心30min，收集上清液即为BSC的粗酶液；(b)将粗酶液依次通过硫酸铵分级沉淀、CM-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephacryl S200HR凝胶层析，最终得到纯的BSC酶；

步骤（6）按如下方法进行：将冷冻干燥后的胶原蛋白分为两部分即第1部分和第2部分，第1部分与第2部分的重量比为3:1-1:1，其中：将第1部分溶于0.5mol/L乙酸溶液中配成2mg/mL的胶原蛋白溶液，在50-60℃下加入复合酶，复合酶为BSC酶和胰蛋白酶的组合， 以1.0%体积分数酶总添加量进行水解，时间为0.5-2.0h，将水解后的胶原蛋白进行透析和浓缩，得浓缩液，然后进行冻干，得到水解后的短肽；将第2部分按照与第1部分相同的酶解方式，区别仅在于酶解时间为前者的1/5，得到轻度水解后的粗肽；

其中该复合牦牛骨胶原蛋白肽粉中的胶原蛋白肽的分子量呈双峰分布，分别分布在700-1000Da范围内和320-400Da范围内。

2.根权利要求1所述的方法，其中将牦牛骨进行脱脂处理包括使用混合有机溶剂对牦牛骨小块进行脱脂。

3.根据权利要求2所述的方法，其中混合有机溶剂为石油醚与氯仿的混合物，二者体积比为1:3-3:1。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述脱矿物处理包括：先用0.5mol/L-1.0mol/L的EDTA溶液对脱脂后的牦牛骨进行处理，在用清水冲洗后，再用0.5mol/L-1.0mol/L的HCl溶液进行处理。