[发明专利]一种融合的TaqDNA聚合酶及其应用

说明书

为实现上述目的，本发明公开一种融合的Taq DNA聚合酶，其为DNA单链结合蛋白Sac7d或DNA单链结合蛋白sso7d分别与野生型Taq DNA聚合酶融合而成。本发明提供的一种融合的Taq DNA聚合酶，增强了扩增过程中与模板链的亲和能力从而提高扩增效率，实现困难模板的扩增，且酶活性稳定，可以直接用血液当模板进行扩增。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种融合的Taq DNA聚合酶及其应用。

背景技术

PCR是分子生物学领域最基本但是最重要的方法，它可以将微量的核酸复制扩大，实现生物学上的研究，大大促进了分子生物学和相关学科的发展。PCR的主要成分包括：反应Buffer、酶、dNTP、模板、引物。这些组分中，每个组分都是PCR扩增不可缺少的，但DNA聚合酶是实现DNA复制的关键，目前针对这些不同的组分，研究者关注最多的是酶的研究，期望通过对酶的改造，实现更多应用，比如：血液直扩、土壤直扩、植物直扩等。

Taq DNA聚合酶存在于水生嗜热菌(Thermus aquaticus)的嗜热DNA聚合酶，可在74℃复制DNA，在95℃仍具有酶活力。该酶可在离体条件下，以DNA为模板，延伸引物，合成双链DNA。其在结构上由三部分构成：DNA聚合酶区、3’核酸外切酶区和5’核酸外切酶区，只有5’→3’DNA聚合酶活性和5’→3’的外切酶活性，缺少3’→5’的外切酶活性。Taq DNA聚合酶是重要的生物技术工具酶，广泛应用于疾病诊断与治疗、传染病检测、药物作用机理等医药领域。

随着医药科技的发展，对Taq酶性能的要求不断提高，野生型的Taq DNA聚合酶已经不能满足特殊PCR技术的要求了，例如用于定点突变时要求聚合酶有较高的保真性，用于长片段扩增时要求聚合酶有较高的扩增效率。由此而带来了多种酶的改造方法，比如：通过制备酶单分子纳米凝胶提高酶的稳定性(化学修饰)；定点突变置换氨基酸，如3’端核酸外切酶区的氨基酸变化使其失去5’→3’的外切功能(分子修饰)等等。目前常用的改造方法有定点突变、定点缺失、基因融合等。

当前对Taq DNA聚合酶改造用的最多的是聚合酶联合应用、定点突变、缺失突变等，通过定向改变氨基酸种类，达到增强某种性能的目的。例如：Taq DNA聚合酶缺乏校正功能，所以将Taq DNA聚合酶和Pfu DNA聚合酶联合应用，利用Taq DNA聚合酶较强的延伸能力和Pfu DNA聚合酶的校正功能，使得扩增可以达到40kb。例如：将Taq DNA聚合酶543位的丝氨酸定点突变为天冬酰胺，可以增强Taq DNA聚合酶和模板引物复合物的相互作用，提高了对高GC含量等困难模板的扩增能力。

很多报道通过酶改造增强了Taq DNA聚合酶的扩增效率、扩增特异性等，但是很少有报道提高了Taq DNA聚合酶在不经过纯化的DNA，实现直接用血液进行扩增。当下用于医院或者工业用户的扩增都是样本数量庞大，如果要先进行DNA提取纯化，再进行扩增，一方面需耗费很长的时间，另一方面DNA交叉污染可能出现很多假阳性，不利于结果的判定。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题，本发明目的提供的一种融合的Taq DNA聚合酶，增强了扩增过程中与模板链的亲和能力从而提高扩增效率，实现困难模板的扩增，且酶活性稳定，可以直接用血液当模板进行扩增。

为实现上述目的，本发明提供一种融合的Taq DNA聚合酶，其为DNA单链结合蛋白Sac7d或DNA单链结合蛋白sso7d分别与野生型Taq DNA聚合酶融合而成。

本发明所述的野生型Taq DNA聚合酶的编码序列优选如SEQ ID NO.3所示。

本发明所提供的融合的Taq DNA聚合酶，编码基因序列如SEQ ID NO.1或SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。

所述的核苷酸序列还可以为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列进行1个或几个核苷酸取代而得到的密码子同义突变的核苷酸序列。