[发明专利]在食气梭菌基因组上快速整合大片段DNA的方法

说明书

本发明提供了一种在食气梭菌基因组上快速整合大片段DNA的方法。具体地，本发明包括步骤：(i)提供一待整合的宿主细胞，所述的宿主细胞的基因组中在待整合的位点处含有外源的attB序列；(ii)将含外源基因的整合构建物引入所述宿主细胞，从而在所述宿主细胞的基因组的待整合位点进行定位重组，从而获得经整合处理的宿主细胞；其中，所述的整合构建物为环状结构，并且包括：ФCD27整合酶的表达盒、ФC31整合酶的表达盒、外源基因的表达盒、ФCD27的attP序列和ФC31的attP序列，其中，ФCD27的attP序列和ФC31的attP序列分别位于外源基因的两侧。本发明方法可以高效、稳定地将大片段DNA整合入杆菌的基因组上。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及在食气梭菌(gas-fermentingclostridia)基因组上快速整合大片段DNA的方法。

背景技术

以一氧化碳、二氧化碳等为代表的一碳气体是储量巨大的廉价碳资源，来源广泛，包括企业废气，以及由含碳物质如煤、石油、天然气以及生物质等气化制备的合成气等。这些一碳资源可经微生物发酵转化为各类大宗化学品以及液体燃料，市场前景巨大。且相比于化学催化路线，一碳气体的生物转化利用路线有其特色，如反应条件温和、对气体组成要求低以及适于合成长碳链复杂结构化合物等。

食气梭菌(gas-fermenting clostridia)是一类具有特殊分解与合成代谢途径的厌氧微生物。能够利用一碳气体(CO，CO₂)合成多种大宗化学品及燃料。因此，食气梭菌作为潜在的重要工业微生物受到广泛关注。国内宝钢集团和新西兰朗泽公司曾在2012年联合建设和完成了基于产乙酸菌发酵的300吨/年“钢厂尾气制乙醇”项目的中试测试。新近报道的首钢朗泽公司全球首套4.5万吨/年工业尾气(CO₂/CO)生物发酵法制燃料乙醇项目也已顺利调试成功。

然而，目前针对食气梭菌的分子操作技术非常有限，造成通过代谢工程改造提升菌株性能的研究进展极为缓慢。

已经报道的针对食气梭菌的分子遗传操作方法包括：(1)利用游离的质粒系统过表达特定功能的基因。(2)借助食气梭菌自身的同源重组系统，通过单交换或双交换的方式失活染色体上的目标基因，或将特定DNA序列整合至染色体上。但由于食气梭菌自身的同源重组系统效率很低，上述操作中必须引入抗性基因作为筛选标记，因此获得的目标重组子的染色体上不可避免地会引入抗性基因，从而影响后续的进一步遗传操作。(3)利用基于二类内含子的Clostron方法对染色体上的目标基因进行插入失活。(4)利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对染色体上的基因进行删除或替换。

但总体而言，上述方法都无法实现在食气梭菌染色体上特异性地引入大片段目标DNA序列(不额外增加抗性基因等筛选标记)。而发展这类技术对于食气梭菌又恰恰极为重要，可以在食气梭菌中快速地整合异源生物合成途径，有效扩展食气梭菌利用一碳气体发酵的目标产品种类。

综上所述，本领域迫切需要开发的高效、稳定地在食气梭菌基因组上引入大片段目标DNA的方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高效、稳定地在食气梭菌基因组上引入大片段目标DNA的方法。

在本发明的第一方面，提供了一种对宿主细胞进行基因组定点整合的方法，包括步骤：

(i)提供一待整合的宿主细胞，所述的宿主细胞的基因组中在待整合的位点处含有外源的attB序列；

(ii)将含外源基因的整合构建物引入所述宿主细胞，从而在所述宿主细胞的基因组的待整合位点进行定位重组，从而获得经整合处理的宿主细胞；

其中，所述的整合构建物选自下组：

(a)第一整合构建物，所述的第一整合构建物为环状结构，并且包括：ФCD27整合酶的表达盒、外源基因的表达盒和ФCD27的attP序列；