[发明专利]针对海南橡胶树叶片组织的超薄切片的制备方法

说明书

本发明公开了针对海南橡胶树叶片组织的超薄切片制备方法，包括制备条件、制备装置、各种试剂的配制和超薄切片制备方法。所述针对海南橡胶树叶片组织的超薄切片制备方法的整个流程是：首先将植物叶片在戊二醛的浸渍液中渗透，再用锇酸固定，乙醇脱水，Epon 812浸透、包埋，修块，超薄切片，用醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，最后进行镜检。本发明解决了在对海南橡胶树叶片用禾本科等类型植物的传统超薄切片制备方法时，出现的在透射电镜制样过程中细胞组织结构不清晰，切片遇水碎裂，包埋剂与组织分离，包埋剂容易受潮等问题，有效缩短了实验操作时间，为橡胶树叶片的超微结构的研究提供了一种有效的技术方法。

技术领域

本发明涉及橡胶树叶片组织的显微形态学领域，具体是针对海南橡胶树叶片组织的超薄切片的制备方法。

背景技术

透射式电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)是通过电子枪发出高速电子束经聚光镜均匀照射到样品上，入射电子与样品会发生碰撞与非弹性碰撞，形成弹性散射电子、损失电子和吸收电子，之后产生的光波再发生干涉和衍射作用，使均匀的入射电子束与样品作用后变得不均匀，再依次经过物镜、中间镜和投影镜放大后在荧光屏上或胶片上呈现出图像，反映出样品信息，它是观察和研究物质亚显微结构或超微结构等微观结构的重要工具。

透射电镜技术最早应用于医学方面，主要观察一些病理切片，从而进行病理变化分析。随着现代科技水平的日新月异，透射电镜技术也在不断改进，使得它在物理材料学、植物生物细胞学都有广泛的应用，例如用透射电镜观察新型纳米材料的微观结构和观察植物的生长发育机理，遗传进化等方面。但目前尚无公开文献报道透射电镜技术在橡胶树叶片超微结构研究方面有成功应用，这与传统超薄切片的制备方法不适用橡胶树叶片密切有关。

巴西橡胶树原产于巴西亚马逊流域，是大戟科橡胶树属热带高大乔木。由于在橡胶树叶片形态结构的研究工作中，光学显微镜仅能观察到植物的栅栏组织，海绵组织，气孔等；但植物细胞超微结构只能通过透射电镜来观察。橡胶树叶片组织的细胞壁厚，结构致密，按传统方法操作时，常导致药液渗透不够充分，除细胞壁外其它结构均模糊不清，无法正常观察和分析。

另外，海南地区的年平均气温22-26℃，年光照1750-2650小时，光照率为50％-60％，光照充足，光合潜力高，常年湿度≥85％，由于海南地区湿度过大，在湿度不能得到精确控制的环境条件下，会因包埋材料块变软导致切片皱缩、破碎，制备切片厚度偏厚，镜检时细胞结构模糊不清，从而导致样本制备失败。

因此，有必要研制一种针对海南橡胶树叶片组织的超薄切片的制备方法，基于以上考量，相对适用于禾本科等类型植物的传统制备方法，在海南地区制备海南橡胶树叶片组织的超薄切片时，应适当加长包埋剂的渗透时间，调整包埋剂的配方，降低并保持实验操作中的环境湿度，以保证超薄切片制备工作的成功开展。

发明内容

本发明的目的在于提供一种针对橡胶树叶片组织的超薄切片制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题，并克服现有方法制备超薄切片方法的不足。

为实现上述目的，在针对性的反复设计开展多次不同的实验之后，我们对常规透射电镜制样部分重要环节进行了改进，包括包埋剂配方、渗透条件、包埋剂聚合等问题。

本发明提供如下技术方案：

针对橡胶树叶片组织的超薄切片制备方法，包括制备条件和制备装置、各种试剂的配制、超薄切片制备方法(其中包括用于观察橡胶树叶片组织的超薄切片的染色方法)。

1.制备条件和制备装置：

(a)调控实验室温度为22℃～30℃，湿度≤45％；

(b)调控摇床为22℃～30℃，湿度≤40％，混匀包埋剂的转速为200rpm/min，渗透转速为100rpm/min；