[发明专利]用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒及其检测方法

权利要求书

1.用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒，其特征在于，包括如下试剂：ccfDNA末端处理体系，环状接头反应体系，0.06-0.15U/ul USER酶，PCR扩增体系，磁珠。

2.根据权利要求1所述的用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒，其特征在于，所述ccfDNA末端处理体系组成有：ccfDNA，0.003-0.007U/ul的T4 DNA聚合酶，0.1-0.3U/ul的T4多聚核苷酸激酶，0.0015-0.0035U/ul的TaqDNA聚合酶，1x T4 DNA连接酶缓冲液，0.2-0.6mM dNTP,0.1-0.3mM ATP，2.5％的粘合剂。

3.根据权利要求1所述的用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒，其特征在于，环状接头反应体系组成有：0.1-0.3U/ul的T4连接酶，1xT4连接酶缓冲液，和0.7-1.2uM的环状接头，所述环状接头的序列为：5’-P-GAT CGG AAG AGC ACA CGT CTG AAC TCC AGT C dU A CAC TCTTTC CCT ACA CGA CGC TCT TCC GAT CT-3’。

4.根据权利要求1所述的用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增体系按照体积份数组成有：15-25份DNA片段，3-8份的引物1和引物2，20-30份的PCR反应master mix；

所述引物1的3’端与环状接头的5’端互补，5’端是用于Illumina测序的P7引物，中间是标签；

所述引物2的3’端与环状接头的3’端互补，5’端是用于Illumina测序的P5引物；

所述PCR反应master mix包括：2x PCR多聚酶和2x的PCR反应缓冲液。

5.根据权利要求4所述的用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒，其特征在于，

所述引物1的序列为：5’CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNNNNN GAC TGG AGTTCA GAC GTG TGC TCT TCC GAT CT-3’，其中NNNNNN是核苷酸的标签；

所述引物2的序列为：5’AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC ACT CTT TCC CTACAC GAC GCT CTT CCG ATC T-3’。

6.用于早期肝癌辅助诊断的试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下内容：

一，从血浆中分离得到ccfDNA；

二，用ccfDNA末端处理体系对ccfDNA进行末端修复，对5’末端磷酸化，加上polyA尾端，得到DNA片段；

三，用环状接头反应体系对得到的DNA片段两端加上环状接头，将环状接头中间用USER酶切开，产生两个互补的单链；

四，用PCR扩增体系对DNA片段进行PCR扩增；

五，采用测序仪对扩增后的产物进行高通量测序；

六，把基因组分成1Mbp的不重合的区域，在每个区域里，用测序深度的加和代表这个区域的拷贝数的量化；

七，用统计算法计算每个片段的拷贝数，然后计算全基因组的拷贝数负荷，用拷贝数负荷来诊断肝癌；

八，挖掘TCGA公共数据库里的肝癌多组学数据，建立贝叶斯非参统计模型量化每个基因是驱动基因的潜力；

九，建立有权重的随机森林的机器学习模型捕获早期肝癌的信号；

十，根据TCGA公共数据库里的数据学到了的驱动基因和拷贝数作为权重，再把权重用在权重随机森林的模型里的训练集上做模型。