[发明专利]焦亡相关蛋白GSDMD在制备菌蜕疫苗中的应用

说明书

本发明公开了焦亡相关蛋白GSDMD在制备菌蜕疫苗中的应用。本发明构建了含有焦亡相关蛋白GSDMD编码基因的溶菌质粒，将其转入肠炎沙门氏菌中，在阿拉伯糖诱导下使细菌裂解，成功获得了沙门氏菌新型菌蜕疫苗。实验证明，GSDMD介导的溶菌具有极长的持续期，裂解率达到99.9985％以上。采用本发明制备得到的新型菌蜕免疫小鼠后，可以刺激机体产生强烈的体液免疫和细胞免疫，诱导了保护性免疫应答并且能够保护实验动物抵抗沙门氏菌感染，说明本发明制备得到的沙门氏菌菌蜕疫苗具有良好的免疫保护效果。

技术领域

本发明涉及溶菌基因及其在制备疫苗中的应用，特别涉及焦亡相关蛋白GSDMD在制备菌蜕疫苗中的应用，本发明还涉及含有编码该蛋白基因的溶菌质粒以及该溶菌质粒在制备菌蜕疫苗中的用途，本发明属于基因工程与免疫学技术领域。

背景技术

菌蜕(Bacterial ghost)是一种没有细胞浆和核酸的细菌空壳。将溶菌基因在细菌中表达，该基因编码蛋白可在细菌外壳形成跨膜孔道结构，在渗透压作用下使菌内胞质内容物通过孔道排出，形成一种空的细菌外壳。菌蜕不具毒力作用，使用安全，是一种绿色疫苗，具有良好的保护效力。菌蜕疫苗具有佐剂性质，可以使其增强免疫反应，如T细胞的活化和黏膜免疫。菌蜕能非特异性增强抗原呈递细胞呈递抗原的能力，且与树突状细胞接触后可增强树突状细胞活化T细胞的能力。这些作为免疫佐剂的特性使菌蜕可以成为优良的免疫佐剂，将其作为灭活疫苗、亚单位疫苗的佐剂能有效的增强疫苗的免疫效果。菌蜕的外膜上存在蛋白质、脂多糖和菌毛，这些免疫刺激复合物被机体的免疫受体识别后，可以引起先天免疫，同时进一步刺激机体产生体液免疫和细胞免疫。另外，菌蜕可以将特异性抗原递呈给抗原递呈细胞，使DC活化T细胞的能力明显增强，能增加很多细胞因子引起机体产生特异性免疫应答作用。特别适合作为黏膜免疫的疫苗，可以同时引起体液免疫和细胞免疫。对于外源靶抗原，菌蜕又是完美的载体，可以接收大量的外源物质。菌蜕上面有菌毛、纤毛等，可以有效结合一些外源物质，还可以定位细胞和组织等，能够有效地对疾病做出预防，且具有治疗作用。利用基因工程手段，可以将外源抗原蛋白插入菌蜕的内膜、外膜或周质等多个部位，构建重组菌蜕多价疫苗。菌蜕也可作为药物传递系统。菌蜕可作为药物递送载体用于装载药物，使药物在患处发挥作用。该方法不但增加了局部药物浓度，同时减少了用药剂量和副作用，菌蜕还具有使药物作用持久而稳定的缓释作用。菌蜕也可以作为亚单位疫苗和DNA疫苗的载体。因此菌蜕载体的出现改进了药物或疫苗的递送方式。而菌蜕的制备常使用发酵方法，而发酵时只需控制温度即可产生菌蜕，无需其他复杂仪器和操作步骤。发酵后可用离心重悬的方法进行收集，并可以冻干后保存于室温，无需像蛋白疫苗那样复杂的纯化工作。节省了时间、节约了资源，无需特定环境储存，减少反复冻融带来的损失。菌蜕为新型疫苗的研制提供了新的模式，是动物用疫病疫苗研制的一个发展方向，其在动物疫苗的研制开发上将会有更加广阔的应用前景。

传统菌蜕的制备，采用噬菌体phiX174的E基因作为溶菌基因，因其安全性问题，噬菌体phiX174的E基因的高效表达要受到严格的控制。另一方面，本发明的前期研究发现，phiX174的E基因作为溶菌基因其持续期最多只能够达到4h，以往的研究对表达系统进行了诸多优化，虽然大大提高了溶菌效率，但也一直存在细菌裂解持续期短的问题，导致菌蜕产率较低。为了解决这一问题，本发明另辟蹊径，首次将编码焦亡相关蛋白GSDMD(gasderminD)的基因作为溶菌基因，在沙门氏菌内诱导表达，裂解持续期能够达到8h，裂解率能够达到99.9985％以上。GSDMD属于Gasdermin蛋白家族，是经典和非经典炎症小体激活后诱导的细胞焦亡所必需的。GSDMD可稳定存在于细胞质中，在接受炎性半胱氨酸蛋白酶刺激后，GSDMD裂解形成的N端结构域能嵌入细胞膜，在脂质膜上形成孔道，是细胞焦亡直接的且唯一的效应器。N端结构域的脂质选择特性使其只能从真核细胞内部破坏细胞膜，在细胞内诱导细胞焦亡、杀死胞内细菌。并且当N端结构域从细胞内释放后，能为胞外细菌所激活且不对其他真核细胞造成损害。这一选择活性能避免组织损伤，控制细菌感染。

本发明克服了以往菌蜕制备过程中裂解持续期短的瓶颈问题，极大的提高了菌蜕产率。并且所制备的新型菌蜕可以刺激机体产生强烈的体液免疫和细胞免疫，诱导保护性免疫应答，具有良好的免疫保护效果。