[发明专利]角膜缘干细胞原代培养方法

说明书

本发明涉及一种角膜缘干细胞原代培养方法。其特征在于经庆大霉素溶液处理后的角膜缘组织剪碎后置于组织消化液中消化、过滤，并将滤液离心后获得的角膜缘组织细胞沉淀进行短暂冻存，再将过滤剩余的组织块（即滤渣）用角膜缘干细胞滋养层培养液重悬，接种于用包被液预处理的细胞培养板进行培养，获得角膜缘成纤维细胞，然后用丝裂霉素C溶液处理生长至对数期的角膜缘成纤维细胞，制成角膜缘干细胞滋养层，最后复苏短暂冻存的组织细胞，用角膜缘干细胞原代培养液重悬后，接种在铺有角膜缘干细胞滋养层的细胞培养板中进行原代培养即得。该角膜缘干细胞安全性高、稳定性好，完好地满足了临床治疗的高要求。

技术领域

本发明属于干细胞培养技术领域，具体涉及一种角膜缘干细胞原代培养方法。

背景技术

研究发现，角膜缘干细胞位于角膜缘基底层独特的波浪形结构“Vogt栅栏”中，是角膜上皮细胞更新的来源。角膜缘干细胞不断的更新能够保持角膜缘上皮细胞连续性的水平向心及垂直向上运动，从而保证角膜上皮层结构的完整和功能的正常。而且角膜缘干细胞的增殖压力能够抑制结膜上皮细胞的长入，并防止角膜缘部的结膜血管入侵。当各种损伤因素，如化学烧伤、机械损伤、病原微生物感染等，会导致角膜缘干细胞的缺失或影响其生存微环境而使其生理功能严重受损时，将引起角膜上皮结构不能重建，结膜上皮及血管翳移行修复角膜表面，导致角膜混浊、视功能下降。因此，必须通过原代培养在体外获得能够快速增殖且保持干细胞属性的角膜缘干细胞，以用于角膜缘缺损/病变的治疗，这也是现今临床移植治疗该类疾病的关键环节。

目前，角膜缘干细胞的原代培养方法较多：角膜缘干细胞的体外分离一般采用组织块迁出法和酶消化法（酶消化法包括IV型胶原酶联合胰蛋白酶、中性蛋白酶联合胰蛋白酶等）；培养采用的滋养层主要包括小鼠NIH 3T3细胞滋养层、小鼠胚胎成纤维细胞滋养层等；培养液成分一般包括血清、生长因子、霍乱毒素、胰岛素、3-碘甲状腺原氨酸、氢化可的松等。

现有的上述角膜缘干细胞的培养方法虽能获得上皮细胞，但都存在一定的局限：在原代培养涉及的体外分离环节中，采用组织块迁出法得到的细胞很容易混有其它种类的细胞，如成纤维细胞，且该成纤维细胞生长速度极快而造成细胞种类混杂；上述的胰蛋白酶为肽链内切酶，对精氨酸和赖氨酸肽链具有选择性水解作用。由于血清中含有非特异性抑肽酶，故胰蛋白酶在有血清存在的情况下无法消化正常组织，但若将组织长时间置于无血清的消化液中进行消化，势必会造成细胞活力的下降；在滋养层的选择方面，NIH 3T3细胞和胚胎成纤维细胞为外生非人源细胞，容易引起免疫反应及鼠源衍生病原体的传播，存在致病风险；在培养液成分的选择上，其中霍乱毒素是霍乱弧菌产生的毒力因子，会引起严重腹泻以及人体脱水，而3-碘甲状腺原氨酸是甲状腺激素的主要活性物质，但高浓度的甲状腺激素能够促进蛋白质分解，引起负氮平衡。上述因素均能影响体外原代培养的角膜缘干细胞的活性和生物安全性。此外，现有方法获得的角膜缘干细胞容易发生分化，从相当程度上丢失了角膜缘干细胞的属性而导致患者移植后存在角膜缘功能不全的风险。

因此，急需建立一种理想的角膜缘干细胞原代培养方法，在保证角膜缘干细胞的生物安全性的基础上，能够很好地维持其干细胞属性而不发生分化，以期用于临床治疗。

发明内容

本发明的目的是提供一种角膜缘干细胞原代培养方法，以克服现有技术的不足，实现临床治疗的需求。

本发明的方法：

首先用无菌0.9%（w/v）生理盐水清洗角膜缘组织（角膜与巩膜之间宽约2 mm的区域，来源于捐献角膜移植后剩余的边角料），再将清洗后的角膜缘组织浸没在庆大霉素溶液中，于37℃处理10 min，而后用无菌PBS平衡盐溶液冲洗3遍，DMEM/F12（1:1）培养基漂洗3遍；

再将上述的角膜缘组织置于500 μl组织消化液中，用眼科剪将组织剪切成大小约0.5~1 mm³的小块；