[发明专利]一种用于修复TPP1基因Pre-mRNA异常剪接的U1-snRNA及其应用

说明书

本发明公开了一种用于修复TPP1基因剪接异常的U1‑snRNA以及含有表达U1‑snRNA的碱基序列的载体，其中，表达所述U1‑snRNA的碱基序列依次包括U1‑snRNA起始碱基、与TPP1基因Exon12剪接供体位点或下游内含子序列靶向互补的序列以及一段U1‑snRNA下游序列，U1‑snRNA下游序列如SEQ ID NO.20所示。本发明的U1‑snRNA来源于针对TPP1基因剪接供体位点或剪接供体位点下游内含子序列而制备的核酸分子；应用U1‑snRNA技术，用靶向目标基因的U1‑snRNA作为靶向药物，在Pre‑mRNA的剪接过程进行修复，从而有效抑制剪接位点突变导致的异常mRNA表达。具有特异性强，高效，副作用小的优点，且能弥补目前治疗异常剪接所致疾病的治疗手段不足，在不久的将来可能成为一种治疗特定类型疾病的新方法。

技术领域

本发明涉及基因修复技术领域，尤其是一种用于修复TPP1基因Pre-mRNA异常剪接的U1-snRNA及其应用。

背景技术

已有研究通过对全基因组数据和细胞系数据进行大量分析，发现Pre-mRNA(mRNA前体)剪接可以将突变与疾病关联在一起。大量的突变被发现通过影响Pre-mRNA剪接而对神经系统疾病，如杜氏肌营养不良症(DMD)和多发性硬化症等疾病进行基因调节。剪接位点突变大约占与疾病相关总突变数的10％，Pre-mRNA剪接在疾病发生中的作用需要重视。

神经元蜡样脂褐质沉积症(neuronal ceroid lipofuscinosis,NCLs)是一组不同类型的溶酶体储存障碍疾病，是一种常染色体隐性遗传的神经退行性疾病，大约每十万新生儿中有2－4例。晚发婴儿型神经元蜡样质脂褐素沉积症(late infantile neuronalceroid lipofuscinosis,LINCL)是NCLs的一种常见类型，由TPP1/CLN2基因突变导致三肽氨基肽酶1(TPP1)活性缺乏引起。在缺乏TPP1时，原本应由该酶分解代谢的溶酶体储存物蓄积在多个器官之中，尤其在大脑和视网膜。这些储存物在神经系统细胞中的蓄积导致持续进行性的神经退行性变，其表现为认知、运动和视觉功能的丧失。该病进展迅速，症状常于2－4之间产生。患者最初表现为语言延迟和癫痫，随后出现活动障碍、运动退化、痴呆和失明。在该病的晚期，进食和完成日常所需变得非常困难，死亡通常发生在8-12岁。

在LINCL患者中检测出TPP1基因的剪接位点突变(c.1551+1GA，表示编码碱基1551后的第一个内含子碱基G突变为A)，该突变引起第12号外显子丢失，影响了该酶的功能。在另一个LINCL患者也检测出TPP1基因剪接位点突变(c.1551+1GT)，可见该位点为容易发生突变的位点。

在晚发婴儿型神经元蜡样质脂褐素沉积症中发现TPP1基因剪接异常，目前的治疗方案是酶替代疗法，它的活性成分(cerliponasealfa)是人类TPP1的重组形式，这正是CLN2患者所需要的。3岁和3岁以上的儿科患者，每隔一周通过脑室内输注一次，推荐剂量为300mg，之后进行电解质输注。输注TPP1重组酶的完整过程，包括了所需的脑室内电解质输注，持续约4.5个小时。为避免过敏反应建议在开始输液前30-60分钟，先施用抗组胺药物或皮质类固醇。

在临床试验中，酶替代疗法的疗效得到了验证，但尚未建立3岁以下患者使用酶替代疗法的安全性和有效性。同时，FDA也公布了一些常见的不良反应，比如发烧、呕吐等。该疗法注射重组酶到患者脑室需要进行手术,由于有创伤性，副作用大，且价格非常昂贵。