[发明专利]基于KASP技术检测κ-酪蛋白基因型的方法

说明书

本发明涉及一种基于KASP技术检测κ‑酪蛋白基因型的方法，包括如下步骤：制备DNA样品；制备好PCR扩增体系；进行PCR扩增；PCR扩增体系中的混合引物包括三种KASP引物：上游突变基因引物、上游未突变基因引物以及下游引物，并且，上游突变基因引物及上游未突变基因引物中，一条设计有HEX荧光标签序列，另一条设计有FAM荧光标签序列；根据PCR扩增后DNA样品的荧光强度，进行基因分型。本发明实现了对奶牛中CSN3三种常见变异体的全面筛选，可充分利用基因检测等领域的资源与技术优势培育优质种牛，发掘奶牛特色种质资源，为牧场选择合适的奶牛，提高乳蛋白率，从种源解决相关领域的技术瓶颈，对奶牛良种产业健康发展具有重要意义。

技术领域

本发明涉及分子生物学及遗传育种技术领域，具体涉及一种基于KASP技术检测κ-酪蛋白基因型的方法。

背景技术

κ-酪蛋白(kappa-casein，k-CN)是牛乳腺分泌的一种含有少量磷酸基的磷蛋白之一。κ-酪蛋白在牛乳中的含量约占总酪蛋白的12％，是凝乳酶的天然底物。并且κ-CN是最重要的酪蛋白之一，它不仅在酪蛋白微团的稳定性方面起至关重要的作用，而且对奶牛泌乳性能、乳成分组成和奶酪品质均有一定程度的影响。

编码κ-酪蛋白的基因被命名为CSN基因，目前研究发现，牛中有多种类型的CSN基因。牛属动物的κ-酪蛋白基因CSN3对蛋白质合成和酪蛋白微胶粒的稳定起重要作用，在奶酪制作中具有重要意义，是凝乳酶的天然底物。牛κ-CN中有15种变异体，均由核苷酸非同义替换造成。最常见的三个遗传变异体是A、B和E，它们在136、148、155、168位氨基酸有差别，A的四位点分别为Thr、Asp、Ser、Ala，而B为Ile、Ala、Ser、Ala，E为Thr、Asp、Gly、Ala。相应的核苷酸替换分别为ACC→ATC、GAT→GCT、AGC→GGC、GCA→GCG。

许多研究表明，κ-CN基因可能会影响乳牛的产奶量、乳脂量、乳蛋白量、乳脂率(F)和乳蛋白率(P)，而且对牛乳的凝固特性和奶酪产量有显著影响。研究表明，κ-CN对乳脂率有显著影响。含κ-CNB变异体的牛奶具有较高的乳脂率、较快的凝乳速度及较高的凝块硬度。κ-CN蛋白遗传多态性对经济性状如干酪制作特性等有着明显的影响。尤其是乳的流变学特性，κ-CNB等位基因对酪蛋白数目显示了正向影响。酪蛋白含量是牛奶作为干酪生产的原料的一个重要指标。因此，对κ-CN基因进行筛选从而提高牛乳制品的质量很有必要。

随着分子生物技术的发展，DNA分析给牛乳蛋白多态性研究带来了新的活力。陆续建立了DNA水平分析乳蛋白遗传变异体的方法，主要方法有PCR-SSCP、PCR-RFLP、直接测序、等位基因特异PCR和基因芯片等,由于前两种方法更易操作且对设备要求不高,应用更为普遍，后三种方法检测准确，但成本较高，不适宜大样本检测。

目前国内尚未有将κ-酪蛋白基因多态性与牛乳加工特性关联，以便筛选出更适合乳酪生产或蛋白产量更高的牛只的报导。

发明内容

有解决现有技术存在的不足，本发明提供了一种基于KASP技术检测κ-酪蛋白基因型的方法，包括如下步骤：

步骤S1：制备DNA样品；

步骤S2：制备好PCR扩增体系，其中，该扩增体系内包括50％体积分数的DNA样品、1.2-1.6％体积分数的混合引物，以及余量的KASP混合液；

步骤S3：进行PCR扩增；

其中，步骤S2中添加的混合引物包括三种KASP引物，分别为上游突变基因引物、上游未突变基因引物以及下游引物，并且，上游突变基因引物及上游未突变基因引物中，一条设计有HEX荧光标签序列，另一条设计有FAM荧光标签序列，以通过根据PCR扩增后DNA样品的荧光强度，进行基因分型。

其中，所述步骤S2中，所添加的混合引物包括四组，其用于分别检测四处突变位点的碱基类型，并且，针对不同的突变位点，设计的引物如下：