[发明专利]“人源性”致心律失常性右室心肌病疾病模型的建立方法

权利要求书

1.一种“人源性”致心律失常性右室心肌病疾病模型的建立方法，包括如下步骤：

1)原代培养获得成纤维细胞

将ARVC患者皮肤组织块用PBS+1％青链霉素润洗，吸走PBS，加入胶原酶于37℃消化6小时；随后加入DMEM+10％FBS+1％青链霉素培养基，置于培养箱培养，等待皮肤组织贴壁，每隔4天换液，当培养皿中成纤维细胞长满后获得P₀代成纤维细胞，冻存保种并传代扩增培养；

2)ARVC病人特异性iPS细胞株的建立

将成纤维细胞种入孔板中，选择1孔刚好长满的细胞进行仙台病毒感染，24小时后换成DMEM+10％FBS+1％青链霉素培养基，每隔1天换液，第7天将细胞传入预先铺有Matrigel的培养皿中，同时培养基改为mTeSR；

将单个克隆挑取到用预先铺有Matrigel的孔板中，此时细胞为ARVC-iPSCP0代，选择细胞致密、外周没有分化的克隆传代到预先铺有Matrigel的孔板中，此时细胞为P1代；选择细胞致密、外周没有分化的3个克隆传代到用预先铺有Matrigel的孔板中，此时细胞为P2代，在孔板中一直将细胞传代至P20代并每1代都进行保种；

3)ARVC病人特异性心肌细胞的获得

采用小分子化合物诱导的2D单层分化方案，其技术路线为：第1天完成iPSCs向中胚层的诱导分化，第1-3天完成中胚层向心脏中胚层的诱导转分化，第4-7天完成中胚层向心肌细胞的诱导分化，第7天以后为心肌细胞的成熟过程；

所述的步骤3)具体操作为：首先将iPSCs按1:8-1:12比例接种至6孔板中，每日更换培养基，当细胞密度达到80％进行分化操作，在分化当天，吸尽陈旧培养基，心肌分化培养基清洗一遍，每孔加入含8μM的CHIR的分化培养基2ml；1天后补充心肌分化培养基；2天后更换成心肌分化培养基，每孔2ml；第3天，每孔加入含5μM的IWR的心肌分化培养基2ml，继续培养2天，第4天补充心肌分化培养基；第5天更换成心肌分化培养基；第7天以后更换成心肌细胞培养基，此时分化效果良好即可看到成片跳动的心肌细胞，即表明“人源性”致心律失常性右室心肌病疾病模型建立完成。

2.根据权利要求1所述的“人源性”致心律失常性右室心肌病疾病模型的建立方法，其特征在于所述的心肌分化培养基为RPMI+B27-Insulin，其中B27minus Insulin占总培养基总量的2％。

3.根据权利要求1所述的“人源性”致心律失常性右室心肌病疾病模型的建立方法，其特征在于所述的心肌细胞培养基为RPMI+B27+Insulin，其中B27+Insulin占总培养基总量的2％。

4.根据权利要求1所述的“人源性”致心律失常性右室心肌病疾病模型的建立方法，其特征在于所述步骤3)中在原有培养基上补充心肌分化培养基的补充量为原培养基的一半。