[发明专利]一种用于全血T淋巴细胞的免疫磁珠的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种用于全血T淋巴细胞的免疫磁珠的制备方法及其应用；包括以下步骤：1）捕获T淋巴细胞的抗体、辅助T淋巴细胞扩增的抗体和偶联剂进行偶联反应；2）将免疫磁珠加入偶联抗体中孵育，得到含有偶联抗体的免疫磁珠，洗涤备用；3）从全血中提取样本细胞，洗涤备用；4）加入含有偶联抗体的免疫磁珠进行孵育；5）洗涤孵育完成的免疫磁珠，弃上清，得到纯化的全血T淋巴细胞；6）将得到纯化的全血T淋巴细胞转移到培养液中，完成全血T淋巴细胞的特异性扩增；本发明采用免疫磁珠法细胞分选扩增技术，利用抗体偶联磁珠实现对全血T细胞的特异性捕获和分选，简单操作便能快速实现全血T淋巴细胞的分离扩增，易于实现自动化。

技术领域

本发明涉及利用免疫磁珠的细胞分离与扩增技术领域，尤其涉及一种用于全血内T淋巴细胞的免疫磁珠的制备方法及其应用。

背景技术

免疫细胞治疗技术是通过采集人体自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量扩增，靶向性杀伤功能增强，然后再回输到患者体内，从而来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变细胞。免疫细胞治疗技术有疗效好、毒副作用低、无耐药性的显著优势，是继传统的手术疗法、化疗和放疗后最具有前景的治疗方案之一。

在免疫细胞细胞治疗技术中，从人外周血中分离出T淋巴细胞和分离出的细胞的体外扩增培养是分开进行的，需要用不同的技术手段来实现，这样极大降低了免疫细胞治疗在体外操作过程中的安全性和工作效率。因此，在细胞治疗领域，急需一种能够将外周血中特定的细胞分离出来大量扩增的技术手段。

免疫磁珠法细胞分选技术是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与连接着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。

全血中的T淋巴细胞特异性表达TCR表面分子，是T淋巴细胞的特异性标记。TCR能够特异性与anti-CD3抗体结合。表面交联有anti-CD3的免疫磁珠通过anti-CD3与TCR的结合，从全血中分离出T淋巴细胞。

免疫磁珠法扩增T淋巴细胞是基于T淋巴细胞表面TCR能与磁珠表面交联的anti-CD3结合，提供T淋巴细胞激活的第一信号；T淋巴细胞表面的CD28能与磁珠表面交联的anti-CD28结合，提供T淋巴细胞激活的第二型号；T淋巴细胞激活后，T淋巴细胞活化增殖。

当前从全血中分离T淋巴细胞主要有以下几类：

1）尼龙绵柱法，根据B细胞易黏附于尼龙绵（聚酰胺纤维）表面，而T细胞则不具备此能力，借此可以将大量B细胞从全血单个核细胞中去除。但是分离效率很低，很多非B细胞的单核细胞如粒细胞、巨噬细胞等无法去除，而且可能会滞留某些T细胞亚群。

2）流式分选法，其原理是在对细胞进行各种荧光的分析测定之后，使液体流束形成含有细胞的带电液滴，这些液滴通过恒定的电场时就能对细胞进行分选。但是流式细胞分选需要大型设备，而且操作复杂，需要专门有经验的操作人员。

3）磁珠分选法，其原理是将特异性细胞表面抗原的抗体结合到磁珠上，形成免疫磁珠。与混合体系中的细胞反应后，利用磁力的作用，使与磁珠结合的细胞与其他细胞分离，达到纯化、分离的目的。

目前，激活T淋巴细胞的主要方法是使用抗人-CD3单抗和抗人-CD28的抗体，或者使用结合由两种抗体的免疫磁珠。但是，这些方法存在操作繁琐，分离培养分开容易产生污染等缺点。

发明内容

针对上述存在的问题，本发明目的在于提供一种用于全血内T淋巴细胞的免疫磁珠的制备方法及其在全血T淋巴细胞的捕获、分离和扩增中应用方法。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种用于全血内T淋巴细胞的免疫磁珠的制备方法，包括如下步骤：