[发明专利]一种调节光滑球拟酵母渗透压胁迫的方法

说明书

本发明公开了一种调节光滑球拟酵母渗透压胁迫的方法，属于生物工程领域。本发明通过过量表达或缺失本源转录因子的编码基因CgRDS2来调节光滑球拟酵母的抗渗透压胁迫能力。结果表明，光滑球拟酵母缺失CgRDS2基因后，与野生型菌株相比，在渗透压胁迫条件下生物量可降低23％，细胞活性下降46％，细胞膜完整性降低47.6％；过表达CgRDS2基因后，菌株在1.5M NaCl胁迫条件下，生物量增加10％，细胞活性增加39％，细胞膜完整性增加12.1％。

技术领域

本发明涉及一种调节光滑球拟酵母渗透压胁迫的方法，属于生物工程领域。

背景技术

光滑球拟酵母作为生产丙酮酸的唯一工业微生物，也用于生产其他有机酸，苹果酸、富马酸、α-酮戊二酸等。在发酵生产有机酸的过程中，胞外有机酸的积累会造成培养基pH的下降，为了维持发酵体系的pH始终处于最适范围，需要流加NaOH、CaCO₃等碱性物质，然而，这类物质的添加会使发酵体系渗透压不断升高，导致细胞活力和生产能力下降。因此，渗透压胁迫是光滑球拟酵母发酵生产有机酸过程中一个亟待解决的问题。目前解决高渗胁迫的方法有：在线分离耦合技术、胞外添加或者基因工程手段强化相容性物质的供给、代谢工程手段改造菌种等。以上方法均提高了高渗条件下有机酸的产量。

目前有研究表明可以通过调节转录因子来抵御外界胁迫环境。转录因子CgAsg1和CgHal9通过调节细胞膜质子泵H⁺ATPase的活性来转运酸胁迫条件下胞内多余的H⁺，以维持胞内正常的pH；转录因子Msn2/4通过上调脂肪酸氧化基因加快胞内三酰甘油代谢以抵御饥饿环境；转录因子Mga2通过调节脂质代谢基因使得脂质组分发生变化以抵御氧胁迫环境；转录因子Cip1通过下调细胞周期蛋白依赖性激酶Cdk1使得细胞周期停滞来应对高渗胁迫；转录因子Gcn4通过下调核糖体蛋白合成基因，使得蛋白质合成能力受损，进而抑制翻译来延长酵母寿命。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种调控光滑球拟酵母渗透压胁迫的方法，通过缺失或过量表达本源转录因子的编码基因CgRDS2。

在本发明的一种实施方式中，所述方法通过过量表达本源转录因子的编码基因CgRDS2增强光滑球拟酵母抵抗渗透压胁迫的能力。

在本发明的一种实施方式中，本发明通过缺失光滑球拟酵母CgRDS2基因，使菌株在渗透压胁迫条件下的生物量和细胞活性下降，从而降低菌株的生长能力。

在本发明的一种实施方式中，所述CgRDS2基因的核苷酸序列是NCBI上gene ID:2891470的核苷酸序列。

在本发明的一种实施方式中，所述光滑球拟酵母菌株是Candida glabrata HTUΔ，基因型为his3Δtrp1Δura3Δ，已于Yan DN,Lin XB,Qi YL,Liu H,Chen XL,Liu LM,Chen J.2016.Crz1p regulates pH homeostasis in Candida glabrata by alteringmembrane lipid composition.Appl Environ Microb 82:6920-6929.论文中公开。

在本发明的一种实施方式中，所述缺失突变具体是：将标记基因CgHIS3同基因CgRDS2的左右臂连接起来，构建敲除框，将测序正确的敲除框导入光滑球拟酵母感受态细胞中，通过同源臂重组将基因CgRDS2替换成CgHIS3，利用重组后的菌株含有CgHIS3基因而能合成组氨酸这一特征筛选缺失CgRDS2基因的的突变菌株，经基因组PCR和测序验证正确的菌株即为缺失CgRDS2基因的菌株Cgrds2Δ。