[发明专利]一种羰基还原酶突变体、表达载体、工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种羰基还原酶突变体，所述羰基还原酶突变体选自SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的第145位的组氨酸突变为丙氨酸，突变位点还包括如下一个或几个：第78位的缬氨酸突变为亮氨酸、第107位的甘氨酸突变为丙氨酸、第204位的谷氨酸突变为精氨酸。本发明所提供的羰基还原酶突变体与原型相比较，对2’‑碘‑5’‑氟苯乙酮具有更优良的催化活性，突变体催化合成手性醇的浓度在100～800mM/L，转化率达90％～99.9％，产率70％～98％，光学纯度大于99％，具有很好的应用开发前景。

技术领域

本发明涉及生物化工技术领域，特别是涉及一种羰基还原酶突变体、表达载体、工程菌及其应用。

背景技术

手性药物的两种对映异构体往往具有不同的功效或其作用效果相差甚远，因此，单一对映体的合成越来越受关注。作为最重要的手性砌块之一，光学活性手性醇被广泛应用于手性药物和精细化学品的合成之中。潜手性酮的不对称还原是制备光学活性手性醇的重要方法，理论上能将100％的底物酮转化为单一对映体的手性醇，具有很高的工业应用价值。

与化学法不对称还原相比，生物催化法在化学选择性、区域选择性和立体选择性方面更具优势，产物光学纯度高；此外，生物催化潜手性酮不对称还原合成手性醇因具有理论产率高、选择性好、副产物少和反应条件温和等优点而成为手性醇绿色合成的优选途径。

羰基还原酶的编码基因如SEQ ID No.1所示，羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示，催化潜手性酮还原制备高光学纯度手性醇已有诸多报道。Peng等利用源于SerratiamarcescensBCRC10948的短链脱氢酶不对称还原1-(3-羟基苯基)-2-(甲氨基)乙酮得到ee值达99％的(R)-苯肾上腺素(Journal of Biotechnology，2014，170：6-9)。Pennacchio等将源于SulfolobusacidocaldariusDSM639的短链脱氢酶用于苯偶酰的不对称还原，转化率和产物的ee值均达到98％(Appl Microbiol Biotechnology，2013，97(9)：3949-3964)。然而，大多数生物催化剂催化潜手性酮不对称还原过程遵循Prelog规则，遵循anti-Prelog规则催化潜手性酮还原的生物催化剂相对较少。大多数羰基还原酶的催化活性远不能满足工业化生产要求，目前应用于工业化的还原酶类催化剂所占比例尚不足总量20％，而且，原型的羧基还原酶催化活性较低，转化率也较低。因此，如何针对特定底物找到具有高催化活性和选择性的生物催化剂是该领域至关重要的问题。

发明内容

本发明的目的是针对上述问题，提供一种催化活性显著提高、高选择性和高转化率的羰基还原酶突变体。

为实现上述目的，根据本发明的第一方面，提供了一种羰基还原酶突变体，所述羰基还原酶突变体选自SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的第145位的组氨酸突变为丙氨酸，突变位点还包括如下一个或几个：第78位的缬氨酸突变为亮氨酸、第107位的甘氨酸突变为丙氨酸、第204位的谷氨酸突变为精氨酸。

进一步地，所述发生突变的氨基酸序列的多点组合突变为：第78位的缬氨酸突变为亮氨酸、第107位的甘氨酸突变为丙氨酸、第145位的组氨酸突变为丙氨酸、第204位的谷氨酸突变为精氨酸；所述羰基还原酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。

根据本发明的第二方面，提供了一种羰基还原酶突变体基因，核苷酸序列如SEQID NO.3所示。

根据本发明的第三方面，提供了一种包含本发明的羰基还原酶突变体基因的核苷酸序列的重组表达载体。这些重组载体可通过本领域常规方法将本发明的羰基还原酶突变体核苷酸序列连接于各种载体上构建而成；所述载体为各种质粒、噬菌体或病毒载体。

进一步地，所述载体为pET-30a。