[发明专利]活体动物双光子激发延时检测荧光成像分析方法及设备

权利要求书

1.一种荧光成像分析设备，用于分析活体动物体内组织和器官中荧光纳米探针的分布和荧光强度，所述设备包括飞秒激光器、荧光探测器、时序控制器、光路控制系统，其特征在于，所述设备还包括用于实施空间光功率密度分布调控，使飞秒激发光在照射平面处形成能量分布均匀的平场线形聚焦飞秒脉冲光斑的光场分布器；所述光场分布器基本上由三个部分构成：对激发光进行扩束的扩束部分，进行光束形状控制的光场控制光阑，以及将经过调整的激光光束聚焦的聚焦部分，其中，所述扩束部分为扩束透镜组或扩束反射镜组中的至少一种；所述光场控制光阑的位置位于扩束透镜组或反射镜组的镜片之间，或位于扩束部分和聚焦部分之间，或位于聚焦部分之后的一侧；所述聚焦部分为透镜、透镜组、反射聚焦镜或反射聚焦镜组中的至少一种；所述光场控制光阑为曲线形光阑，所述曲线形光阑的光透过或光反射区域为两条曲线型和两条直线型边框围成的区域，所述曲线的形状根据将光功率密度呈高斯分布的飞秒激光束变化为线形平场飞秒激光束的需要计算获得；所述飞秒激光器发出红色或近红外脉冲激光，利用所述光场分布器使原本可在照射平面处形成能量呈高斯分布的飞秒激光束在照射平面处形成能量分布均匀且保持飞秒脉冲特性的平场线形聚焦飞秒脉冲光斑，该光斑在时序控制器和光路控制系统的控制下投射到动物体内的待测部位上，并对待测部位的荧光纳米探针进行线扫描双光子激发发光，然后在时序控制器和光路控制系统的控制下通过荧光探测器对上述发光进行延时检测，实现对生物样品内探针进行线扫描双光子激发、时间分辨荧光成像分析。

2.根据权利要求1所述的设备，其特征在于，所述设备还包括用于实现光源、样品和/或荧光探测器移动的运动平台。

3.根据权利要求1所述的设备，其特征在于，所述荧光探测器是ICCD探测器和/或成像光谱仪。

4.根据权利要求1所述的设备，其特征在于，所述光场分布器中，由凹透镜和凸透镜组成扩束透镜组，光场控制光阑位于扩束透镜组的两片透镜之间，经过调整的激光光束被柱面凸透镜聚焦后形成线形激发光斑；所述扩束透镜组、光场控制光阑和柱面凸透镜置于电控平移台上，在所述电控平移台的驱动下对待测成像部位进行激发光斑的可控扫描。

5.根据权利要求1所述的设备，其特征在于，所述光场控制光阑为透射光阑或反射光阑。

6.根据权利要求1所述的设备，其特征在于，所述设备还包括用于放置待测动物的样品平移台，所述光路控制系统包括二向色镜、物镜组、转向反射镜和成像透镜组，所述荧光探测器包括ICCD和/或成像光谱仪，所述光场分布器带有电控平移台；飞秒激光器发出的激光经光场分布器的调节和聚焦控制后经过二向色镜的反射，形成飞秒激发光束照在样品平移台上的待测动物的待测部位上；所述飞秒激发光束在光场分布器的电控平移台驱动下扫描激发待测部位的不同位置；拍摄像场与样品之间的位置改变通过样品平移台驱动样品移动来实现；产生的信号光透过二向色镜被物镜组收集，然后经过转向反射镜和成像透镜组后由ICCD探测，和/或，经过转向反射镜和另一成像透镜组后由成像光谱仪和另一ICCD探测。

7.根据权利要求1所述的设备，其特征在于，所述时序控制器为可编程控制的延时发生器，飞秒激光器输出的激光同步信号输出至延时发生器，延时发生器控制飞秒激光脉冲与荧光探测器采集时间之间的精确延时关系；所述设备还包括样品平移台，所述光场分布器带有电控平移台，样品平移台和光场分布器的电控平移台由平移台控制器控制；通过计算机给延时发生器和平移台控制器设定的参数，控制成像采集的空间位置和飞秒激光照射的具体位置；通过计算机设定参数，经快门控制器控制快门的通断，决定激光脉冲在荧光探测器进行采集工作之前的恰当时间激发样品，并在设定的时间窗口内收集特定部位的荧光信号。