[发明专利]PIK3CA基因E545K突变数字PCR检测体系的优化方法及检测产品在审

专利信息
申请号: 201811190339.7 申请日: 2018-10-12
公开(公告)号: CN109295222A 公开(公告)日: 2019-02-01
发明(设计)人: 赵新泰;王明;潘文健 申请(专利权)人: 上海赛安生物医药科技股份有限公司
主分类号: C12Q1/6886 分类号: C12Q1/6886;C12Q1/6858;C12Q1/6851
代理公司: 上海海颂知识产权代理事务所(普通合伙) 31258 代理人: 任益
地址: 200436 上*** 国省代码: 上海;31
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摘要:
搜索关键词: 数字PCR 野生型 检测 突变型模板 突变 荧光区域 标准品 优化 酶切 突变型探针 野生型探针 反应数据 上游引物 数据统计 突变片段 突变频率 突变质粒 下游引物 正常人体 准确度 拷贝数 突变型 制作
【说明书】:

发明涉及一种PIK3CA基因E545K突变数字PCR检测体系的优化方法,检测体系包括上游引物、下游引物、野生型探针、突变型探针、野生型模板和突变型模板;野生型模板是酶切后的正常人体gDNA,突变型模板是酶切后的插入PIK3CA基因E545K突变片段的突变质粒;将突变型模板和野生型模板按一定的拷贝数比例配制成标准品,采用数字PCR以中突变频率标准品为模板进行反应,根据反应数据制作数据统计图,选定野生型的荧光区域和突变型的荧光区域。采用数字PCR以野生型模板为模板进行反应,确定背景阈值。通过本发明的PIK3CA基因E545K突变数字PCR检测体系的优化方法优化后的检测产品准确度更高。

技术领域

本发明涉及检测人类PIK3CA基因E545K突变的数字PCR检测产品及其优化方法,属于生物技术领域。

背景技术

磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3Ks)是一种脂质激酶,参与细胞存活、运动、黏附和凋亡等多种细胞生理功能的调节。PIK3是由调节亚基p85和催化亚基p110组成的异源二聚体,PI3Ks的p110α催化亚基由PIK3CA基因编码,定位于3q26.3,长34kb。PI3Ks受到生长因子受体酪氨酸激酶如表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、胰岛素受体等激活,充当细胞内部的一个信号传递者。活化后的PI3Ks催化磷脂酰肌醇4磷酸(PI-4-P)和磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PI-4,5-P2)磷酸化成磷脂酰肌醇3,4二磷酸(PI-3,4-P2)和磷脂酰肌醇3,4,5三磷酸(PI-3,4,5-P3,Ptd InsP3)。从而活化一系列蛋白,包括调节细胞增殖、存活和细胞周期调控等。PIK3CA基因发生突变,会导致激酶活性增强,激活PI3K通路的下游AKT通路,减少细胞增值对于生长因子的依赖,增加肿瘤细胞的浸润和转移。当PIK3CA基因因突变而激活时,通过PI3K-AKT途径可使AKT过度激活,无限制的促进细胞生长和繁殖,并抑制细胞凋亡,最终导致肿瘤发生。在多种癌症中发现PIK3CA基因突变的存在,其中在肝癌36%、乳腺癌中突变率为26%、结直肠癌中突变率为25%、肺癌中突变率为2%。PIK3CA基因约4/5的突变发生在9外显子(E542K、E545D、E545K突变位点)和20外显子(H1047R、H1047L)这两个热点区域。具有上述突变的患者对EGFR、HER2靶向药物治疗存在耐药性。例如,PIK3CA基因突变的乳癌患者对ErbB1/ErbB2双重酪氨酸激酶受体抑制剂拉帕替尼(TYKERB,商品名Tykerb)在内的常规HER2靶向治疗耐药。PIK3CA基因突变乳腺癌患者对Her2靶向药物注射用曲妥珠单抗耐药,PIK3CA基因突变结直肠癌患者对以EGFR为靶点的单克隆抗体西妥昔单抗产生耐药。因此,在癌症治疗过程中,对癌症患者进行PIK3CA基因的特定突变进行检测,是做到精准用药的关键,也可防止药物勿用带来的经济损失与治疗时间延误。

传统的针对对基因特定位点的突变检测常用的方法有一代测序和qPCR,但其灵敏度较低,因此需要具备高突变比例的组织标本进行检测,不适合实时检测监控。血浆游离DNA(cfDNA)是存在于血浆中的一种小片段DNA,平均长度在180bp,由体细胞产生释放进入血液。ctDNA是由肿瘤细胞释放进入血液的片段化DNA,因此,可通过检测ctDNA中的突变信息反应肿瘤细胞的突变信息。对cfDNA中的ctDNA的检测成为检测肿瘤突变的一种途径。cfDNA用于肿瘤突变检测优势在于操作无创,可实现实时检测和动态监测,克服肿瘤组织的异质性。然而,ctDNA所占cfDNA的含量极低,低于百分之一,传统检测方法无灵敏且准确的检测出血浆游离DNA中所包含突变信息。

数字PCR(dPCR)的出现革新了传统PCR检测的发展,极大的提高了检测的灵敏度。通过统计大量的单拷贝反应微滴,大大的提高了准确度和精密度。由于dPCR统计的是单个分子总数,理论上能做到每个反应单位为单拷贝模板。因此,数字PCR可以达到绝对定量。

发明内容

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