[发明专利]一种提高胚乳生物反应器中重组蛋白表达水平的方法

说明书

本发明提供一种提高胚乳生物反应器重组蛋白表达水平的方法，所述方法利用储藏谷蛋白突变体(LGC‑1)杂交、基因编辑(TALEN技术和CripsrCas9)技术定向敲除内源储藏蛋白基因，降低内源储藏蛋白含量，缓解内质网胁迫，改善重组蛋白在胚乳细胞转运效率，从而提高重组蛋白在胚乳细胞的表达，实现Oryz^HiEXP技术平台下重组蛋白水稻品系的产量提高和外源重组蛋白表达水平的显著提高。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种通过降低内源蛋白表达，缓解内质网胁迫的技术途径，来提高胚乳生物反应器重组蛋白表达水平的方法。

背景技术

自1986年以来利用农业生物制药技术通过植物细胞生产在医药、疾病治疗、分子疫苗等方面有着广泛的用途的重组蛋白。由于农业生物制药技术存在表达量低、工艺复杂和规模化困难的问题，一致不能进入市场。因此提高重组蛋白的表达量是农业生物制药的关键核心技术。提高表达量通常采用较强转录活性的启动子、密码子优化和定向储存等技术来提高表达量，本申请人早期采用水稻胚乳特异性启动子、水稻偏爱密码子优化、蛋白质定向存储等综合技术策略 (Oryz^HiExp技术)，实现了多种重组蛋白在水稻胚乳中特异性高水平表达，最高表达量达到了2.76克/公斤糙米(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2011，108(47):19078-19083)，表达量已经达到现有技术的极限(PlantCell Report.2014， 33:585–594；NatureNews)。然而通过对高效表达重组蛋白的水稻胚乳细胞的细胞学和分子生物学分析，发现当重组蛋白在水稻胚乳细胞超量表达后，胚乳细胞中的内质网和蛋白体的细胞学形态发生显著改变(JournalofProteomeResearch, 2009，8,829–837；JournalofBiotechnol.2012，164：300-308；Plant MolecularBiology. 2013,83:153-161)，对其分子机理的研究结果，发现协助蛋白折叠分子伴侣分子提高，内源蛋白显著降低，与此同时，胚乳细胞为了应对超量表达重组蛋白，通过启动未折叠蛋白的应急反应(UnfoldingProteinResponse，UPR)，对外源蛋白进行泛素化，然后介导重组蛋白进入26S蛋白酶体进行降解，以缓解内质网胁迫，保证细胞正常的生长(JournalofProteomeResearch,2009，8,829–837)。

根据以上研究结果和发现，要继续提高重组蛋白在胚乳细胞的表达，仅靠提高转录水平，增加mRNA水平是不够的，在超量表达重组蛋白时，过量外源基因的表达，重组蛋白与内源蛋白与内源蛋白基因不仅在基因转录，而且在转译水平上在蛋白转运、蛋白合成、运输和储藏空间等资源进行竞争，在造成内质网胁迫(ERStress)，而胚乳细胞为了应对胁迫，被动地启动一系列应急反应，包括通过增加分子伴侣加快蛋白折叠，最后启动UnfoldingProteinResponse，UPR (Annu.Rev.Med.1999,50,57–74；Mol.Biotechnol.2006,34(2),279–90.)，26S 蛋白酶体的蛋白质降解途径来降解过量的蛋白质，缓解内质网胁迫，保障细胞正常发育(图1)。因此，我们假设如果主动通过降低内源蛋白含量，减少胚乳细胞的基因转录、转译和蛋白转运与储藏的负担，就可以提高外源蛋白的表达量(图2)。

发明内容

本发明的目的是针对重组蛋白在水稻胚乳细胞超量表达后引起的内质网胁迫，导致内源蛋白含量降低，细胞启动UPR反应，降解内源和外源蛋白的研究结果，提出通过降低内源储藏蛋白含量，缓解胚乳细胞胁迫的技术路线，可以改善重组蛋白的转运效率，提高重组蛋白的表达量。