[发明专利]EGFR基因T790M突变数字PCR检测体系的优化方法及检测产品

说明书

本发明涉及一种EGFR基因T790M突变数字PCR检测体系的优化方法，检测体系包括上游引物、下游引物、野生型探针、突变型探针、野生型模板和突变型模板；野生型模板是酶切后的正常人体gDNA，突变型模板是酶切后的插入EGFR基因T790M突变片段的突变质粒；将突变型模板和野生型模板按一定的拷贝数比例配制成标准品，采用数字PCR以中突变频率标准品为模板进行反应，根据反应数据制作数据统计图，选定野生型的荧光区域和突变型的荧光区域。采用数字PCR以野生型模板为模板进行反应，确定背景阈值。通过本发明的EGFR基因T790M突变数字PCR检测体系的优化方法优化后的检测产品准确度更高。

技术领域

本发明涉及检测人类EGFR基因T790M突变的数字PCR检测产品及其优化方法，属于生物技术领域。

背景技术

在世界范围内，肺癌是发病率和死亡率位居首位的恶性肿瘤。在肺癌患者中，非小细胞肺癌(NSCLC)的发生率为85％，其中超过7成处于中晚期。其中，表皮生长因子受体基因(EGFR)是我国肺腺癌发生的主要驱动基因。

表皮生长因子受体(EGFR)属于络氨酸激酶型受体，贯穿细胞膜，其胞内部分为其激酶活性区域。激活后的EGFR单体转化为激活状态的二聚体，可引导下游的磷酸化，诱导细胞的增值。EGFR基因络氨酸激酶活性区域包含一系列的激活突变，其中常见的有包括19号外显子中碱基的确实和21号外显子中的点突变(L858R)。EGFR络氨酸激酶抑制剂(如：厄洛替尼和吉非替尼)对携带络氨酸激酶区域至活突变的患者具有较灵敏的效果。但是，具有络氨酸激酶抑制剂(TKI)敏感突变的患者，会在2年内产生药物抗性。抗性的产生60％是由于EGFR基因T790M突变引起的。针对EGFR-TKIs耐药性，已经产生多种新一代的药物，这些药物可抑制具有T790M突变的激酶活性。因此，为达到准确用药的目的，对EGFR基因的T790M突变的检测成为必要。

传统检测T790M突变的方法采用的组织活检，这种方法存在取材难，具侵入创伤问题。此外，传统的组织活检存在肿瘤组织异质性的局限。循环肿瘤DNA(ctDNA)是指来自于肿瘤组织释放进入血浆的DNA，携带有来自肿瘤组织的实时信息。因此，对ctDNA进行检测，不仅可以做到无创伤，并且可以做到实时观测及时调整治疗方案。但是，由于存在于血浆中的ctDNA含量不足1％且高度片段化(180bp)，而普通ARMS-PCR灵敏度最高可达到百分之一无法达到检测要求。

数字PCR(dPCR)的出现促进了传统PCR检测的发展，极大的提高了检测的灵敏度。通过统计大量的单拷贝反应微滴，大大的提高了准确度和精密度。由于dPCR统计的是单个分子总数，理论上能做到每个反应单位为单拷贝模板。因此，数字PCR可以达到绝对定量。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可以使得数字PCR反应体系检测的准确度有更高的EGFR基因T790M突变数字PCR检测体系的优化方法，以及通过该优化方法优化后的检测产品。

本发明为解决上述技术问题提出的一种技术方案是：一种EGFR基因T790M突变数字PCR检测体系的优化方法，所述检测体系包括上游引物、下游引物、野生型探针、突变型探针、野生型模板和突变型模板；所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，所述野生型探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述突变型探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；所述野生型模板是酶切后的正常人体gDNA，所述突变型模板是酶切后的插入EGFR基因T790M突变片段的突变质粒；

将突变型模板和野生型模板按1:50至1:200的拷贝数比例配制成中突变频率标准品，采用数字PCR以中突变频率标准品为模板进行反应，根据反应数据制作数据统计图，选定野生型的荧光区域和突变型的荧光区域，突变型的荧光区域与野生型的荧光区域中荧光信号拷贝数的比值与中突变频率标准品中突变型模板和野生型模板的拷贝数比例相同；