[发明专利]一种检测烟叶中青枯病菌的时间分辨荧光定量试纸条及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种检测烟叶中青枯病菌的时间分辨荧光定量试纸条，包括样品吸收垫、结合物释放垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板；其特征在于：所述的结合物释放垫上喷涂有时间分辨荧光微球标记的青枯病菌检测抗体；所述的硝酸纤维素膜上包被有青枯病菌捕获抗体的检测线和羊抗鼠二抗的质控线；所述青枯病菌捕获抗体及青枯病菌检测抗体是由青枯病菌或青枯病菌外泌蛋白为免疫原制备获得具有不同表位的单克隆抗体；

所述青枯病菌外泌蛋白是通过构建质粒，利用大肠杆菌表达体系表达、纯化制备获得；

制备青枯病抗体的免疫原为青枯病菌时，是指青枯病亚洲分支序列变种13、15、17和34，是通过平板培养纯化所得；

所述青枯病菌外泌蛋白是指多聚半乳糖醛酸内切酶、果胶酶、外多聚半乳糖醛酸酶、海藻酸裂解酶。

2.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述样品吸收垫、结合物释放垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘贴在底板上，且结合物释放垫1/3~1/2被覆盖于样品吸收垫下。

3.根据权利要求1所述的试纸条，其特征在于：所述时间分辨荧光微球是直径为100 nm~500 nm的稀土离子作为标记物的荧光微球，其表面修饰有合适密度的羧基或其他功能基团，用于蛋白、抗体和核酸的共价偶联。

4.一种制备权利要求1-3任一项所述试纸条的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）制备喷涂有青枯病菌检测抗体-荧光微球标记物的结合物释放垫；

2）制备包被有青枯病菌捕获抗体的检测线和包被有羊抗鼠二抗的质控线的硝酸纤维素膜；

3）将1）和2）制备好的结合物释放垫、硝酸纤维素膜与样品吸收垫、吸水垫和底板组装成试纸条。

5.根据权利要求4所述的试纸条的方法，其特征在于，在步骤1）中，在喷涂青枯病菌检测抗体-荧光微球标记物之前，结合物释放垫用含0.2~1w/w%牛血清白蛋白、pH 7.4的0.02~0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液浸泡2 h，37℃下烘干2 h，该Tris-HCl缓冲液含0.1~5 %的海藻糖和0.02~0.1% Tween-20。

6.一种应用权利要求1-3任一项所述试纸条检测烟叶中青枯病菌的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

1）对烟叶进行前处理；

2）用权利要求1-3任一项所述的试纸条进行检测，可给出烟叶中青枯病菌的准确定量结果；

3）分析检测结果：定量试纸条硝酸纤维素膜上荧光信号可被免疫荧光分析仪快速读取；

4）免疫荧光分析仪可准确读取365 nm激发、610 nm发射的荧光信号，具体形式分为台式检测和手持式检测。