[发明专利]分散固相萃取-液相色谱-质谱/质谱法同时测定蜂王浆中双甲脒及代谢产物残留量的方法

说明书

本发明涉及蜂王浆中双甲脒及其3种代谢产物残留量测定的方法，尤其涉及分散固相萃取‑液相色谱‑质谱/质谱法同时测定蜂王浆中双甲脒及其代谢产物残留量的方法。该方法在试样中加入pH=9的缓冲溶液稀释后用乙腈、氯化钠沉淀蛋白、提取、盐析，通过含有N‑丙基乙二胺（PSA）、无水硫酸镁和C18粉末的吸附剂进行分散固相萃取对提取液进行净化，采用液相色谱‑质谱/质谱仪检测，同位素内标稀释内标法定量。该方法绿色友好、简便快捷，消耗资源小，检测成本低，方法灵敏度能满足蜂王浆中双甲脒及其代谢产物残留量的检测和确证要求。

技术领域

本发明涉及蜂王浆中双甲脒及其代谢产物残留量测定的方法，尤其涉及一种分散固相萃取-液相色谱-质谱/质谱法同时测定蜂王浆中双甲脒、单甲脒2,4-二甲基苯基甲酰胺和2,4-二甲基苯胺残留量的方法。

背景技术

蜂王浆(royal jelly)，是蜜蜂巢中培育幼虫的青年工蜂咽头腺的分泌物，也是供给将要变成蜂王的幼虫的食物和蜂王终身的食物。研究发现，蜂王浆就像哺乳动物的乳汁极具营养价值和免疫功能而且含有极高的长寿因子。营养学家认为蜂王浆是一种可供人类直接服用的高活性成分的超级营养食品。近些年研究表明，蜂王浆具有辅助降低血糖，抗氧化，降低血脂，控制血管扩张，降低血压，保护肝脏，抗菌消炎以及提高免疫力抗衰老等医疗和保健的功效，因此越来越受到人们的关注与欢迎。

中国是世界蜂王浆第一生产国，也是第一出口国，世界上90％以上的蜂王浆来自于中国，主要出口国家和地区有日本，欧盟和美国等发达国家和经济体。蜂王浆也是除蜂蜜外最具市场竞争力和高附加值的蜂产品。伴随着人民生活水平的提高，对蜂王浆质量要求也在不断的提高。蜂王浆中药物残留情况一直是消费者除营养成分外的主要关注点，我国药物和抗生素曾经的滥用情况较为突出，蜂蜜等蜂产品中氯霉素等的药物检出曾对其出口造成严重的不利影响。

双甲脒(Amitraz)，又称N,N-双(2,4-二甲苯亚氨基甲基)甲胺，是一种有机氮杀虫、杀螨剂，其具有触杀和熏蒸作用，对叶螨科各发育阶段的虫态都有效。因此广泛用于果树、蔬菜、茶叶、棉花、大豆、甜菜等作物防治多种害螨，对同翅目害虫也具有良好药效，还可以用于防治蚜虫、棉铃虫、红铃虫等害虫。对牛、羊、猪等家畜体外寄生螨也有效，可以防治体虱、壁虱、疥癣和恙虫等，在蜂蜜养殖中对蜂螨有较好的防治效果，且对蜜蜂属于低毒性，因此曾被广泛用于蜂巢除螨。根据双甲脒的化学性质，其可发生代谢或降解，先形成单甲脒(N-2,4-Dimethyl phenyl-N-methylformamidine，DMPF)、2,4-二甲基苯基甲酰胺(N-(2,4-DiMethylphenyl)formamide，DMF)，最终降解为2,4-二甲基苯胺(2,4-Dimethylaniline，DMA)。其中单甲脒既是双甲脒的一个代谢产物，其自身也是杀螨剂，能防治抗三氯杀螨醇的螨，杀螨卵、若螨和成螨，对棉红铃虫、水稻三化螟和二化螟也有一定活性。单甲脒在防治柑橘、苹果、棉花等作物上的螨，对瓢虫、草蛉、食虫蝽象、食螨瓢虫、棉田蜘蛛、蜜蜂、家蚕比较安全，其毒性较双甲脒要低。2,4-二甲基苯胺在化工合成中通常作为单甲脒和双甲脒的合成原料而被使用，但研究表明2,4-二甲基苯胺具有毒副作用和致突变性，对肝脏的损伤较大。

通过食物链传播或直接在蜂巢中使用双甲脒后，所产生的蜂王浆比较容易被双甲脒及其代谢产物污染，进而影响消费者的身体健康，如表1所示，各国纷纷制定双甲脒在蜂产品中(以蜂蜜居多)的最低限量，来保证其的质量安全。

表1主要国家和经济体对蜂产品中双甲脒的限量要求

韩国等国家虽然在蜂王浆中并未明确规定双甲脒的限量要求，但在猪肉等其他动物源性产品以及果蔬产品中双甲脒的最低限量都有明确规定，我国在出口蜂王浆的残留监控中也明确要求双甲脒不得检出(同时检测代谢产物)。

基于双甲脒的稳定性以及代谢情况和检测手段的限制，目前食品中双甲脒残留量的测定通常是将样品进行通过酸、碱环境下高温水解后对最终代谢产物2,4-二甲基苯胺进行测定，再数学转化成双甲脒的含量。其中以气相色谱法或者气相色谱-质谱法为主。